<<
>>

2.2.11.1 Коррекция молярных спектров поглощения дезоксигемоглобина A

При расчете молярного спектра поглощения дезоксигемоглобина A в основу был положен спектр поглощения дезоксиформы, полученной барботацией азотом раствора гембелка, выделенного, в свою очередь, из крови доноров.

Так как ранее вычисленная доля фетального гемоглобина в растворах гембелка (полученного из крови доноров) невелика и находится преимущественно в оксиформе (> 95 %), то долей фетального мет- и карбоксигемоглобина можно пренебречь.

^A630 * k

MtHbA _ CNMtHbA , 8630 8630

Содержание метформы в исходном (до дезоксигенации) растворе гемоглобина было определено цианидным способом с помощью ацетонциангидрина (см. 2.2.5) и рассчитано по уравнению (11):

где АЛ630 — разность в поглощении растворов гемоглобина до и после добавления ацетонциангидрина; e^f4 и е™^14 — молярные показатели поглощения

метгемоглобина и цианметгемоглобина при длине волны 630 нм соответственно; k — коэффициент разбавления раствора.

Доля метгемоглобина будет рассчитана из отношения (12):

Из молярного спектра поглощения дезоксигемоглобина (с максимальным содержанием его основной формы) будет вычтен, в соответствующей доле, полученный ранее (см.

2.2.11.1) итоговый спектр молярного поглощения метгемоглобина Л.

Кроме учета доли метгемоглобина, необходимо также откорректировать спектр дезоксигемоглобина на присутствие в нем доли спектра карбоксигемоглобина.

Для этого в герметичной кювете к исходному раствору гемоглобина (из которого получали дезоксигемоглобин барботацией азотом) добавляли восстановитель — кристаллы дитионита натрия. При этом происходит восстановление метгемоглобина до дезоксиформы (в отличие от барботации азотом), а также дезоксигенация оксиформы.

Расчет выполняли по следующему уравнению (13) [107]:

где Л419 — максимум поглощения карбоксиформы, Л419 — изосбестическая точка HbCO/Hb (значение при 425,5 нм в данном случае получено интерполяцией точек в спектре с длиной волны 425 нм и 426 нм).

Доля карбоксигемоглобина будет рассчитана из отношения (14):

_ [НЬлСО]

ЮНЬлСО _ [Hbtotal ] . (14)

Из молярного спектра поглощения дезоксигемоглобина (с максимальным содержанием его основной формы) будет вычтен, в соответствующей доле, итоговый спектр молярного поглощения карбоксигемоглобина (см. ниже,

2.2.11.3) .

Получение дезоксигемоглобина различными путями (барботация азотом и восстановление дитионитом натрия) обусловлено тем, что дитионит натрия сильно поглощает в УФ-области спектра. Это не позволяет выполнить вычитание оптически пустого раствора с этим восстановителем при заданных ограничениях на уровень сигнал/шум в спектрах поглощения образцов гемоглобина.

Кроме этого, дитионит натрия в водных растворах очень хорошо окисляется не только за счет метформы, но и собственно за счет растворенного и дополнительно растворяющегося и связывающегося с гемоглобином кислорода из-за манипуляций, требующих разгерметизации кюветы. Это, в свою очередь, не позволяет контролировать в такой системе содержание продуктов окисления дитионита натрия (хотя бы на уровне постоянной систематической ошибки).

В совокупности, разность в поглощениях окисленной и восстановленной форм дитионита натрия, а также ошибок, возникающих из-за неконтролируемой концентрации и соотношения этих форм, приводит к существенным погрешностям в спектрах поглощения дезоксигемоглобина в областях, перекрывающихся с поглощением окисленного/восстановленного дитионита натрия (т.е. менее 380 нм). Аналогичная ситуация при определенных обстоятельствах (не избыточное содержание реагента) также может возникать для окисленной и восстановленной форм гексацианоферрата калия (см. 2.2.4.4 и 2.2.5).

Так как при дезоксигенации фетальный оксигемоглобин перешел в дезоксиформу, то из-за разницы в поглощении гемоглобинов A и F в области ароматических аминокислот (менее 320 нм) его также необходимо учесть.

Для этого раствор фетального гемоглобина, полученный из кордовой крови, дезоксигенируется азотом путем барботации. В результате раствор в основном содержит дезоксигемоглобин A и F (> 95 %). Долей мет- и

карбоксигемоглобина, в данном случае, можно пренебречь. Так как доля фетального гемоглобина известна (получена ранее, уравнение (8)), то тогда спектр дезоксигемоглобина, содержащий преимущественно долю фетального (порядка 80 %), будет вычтен из основного спектра дезоксигемоглобина (полученного из крови доноров), исходя из соотношений (15):

где юШг, — доля, с которой будет вычитаться молярный спектр фетального

дезоксигемоглобина, рассчитывается как отношение доли фетального гемоглобина в растворе дезоксигемоглобина, полученного из крови доноров (ю^ ), к доле такового, полученного из кордовой крови (ю,^ ).

Так как из молярного спектра поглощения дезоксигемоглобина вычитаются в соответствующих долях мет- и карбоксигемоглобин A, дезоксигемоглобин F, то итоговый спектр должен быть откорректирован путем умножения молярных показателей поглощения на коэффициент g, уравнение (16):

1

g = ту------- у--------- у----- . (16)

1 юммьА юньАсо юньг.

Таким образом, получаем итоговый молярный спектр поглощения дезоксигемоглобина А.

<< | >>
Источник: Лавриненко Игорь Андреевич. РАЗРЕШЕНИЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ПЕРЕКРЫВАЮЩИХСЯ ПОЛОС ПОГЛОЩЕНИЯ ХРОМОФОРОВ НЕКОТОРЫХ ПРОСТЫХ И СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ В ДИАПАЗОНЕ ДЛИН ВОЛН 240-320 НМ. 2015

Еще по теме 2.2.11.1 Коррекция молярных спектров поглощения дезоксигемоглобина A:

  1. 1.1. Рентгеноэлектронные спектры Р-дикетонатов европия (III)
  2. 1.1 Структура, электронные, магнитные и спектральные свойства простетической группы гемопротеидов
  3. 2.2.5 Регистрация спектров поглощения: спектрофотометры и протокол измерения
  4. 2.2.5 Подходы, направленные на снижение фотометрических ошибок и увеличение разрешения в спектрах поглощения
  5. 2.2.5 Коррекция молярных спектров поглощения производных гемоглобина на присутствие неосновных компонент
  6. 2.2.11.1 Коррекция молярных спектров поглощения метгемоглобина Д
  7. 2.2.11.1 Коррекция молярных спектров поглощения дезоксигемоглобина A
  8. 2.2.11.1 Коррекция молярных спектров поглощения карбоксигемоглобина А
  9. 2.2.11.1 Коррекция молярных спектров поглощения оксигемоглобина A
  10. 2.2.11.1 Коррекция молярных спектров поглощения оксигемоглобина F