<<
>>

3.3 Идентификация полос поглощения в спектрах белков путем их сопоставления в системе «аддитивная модель апобелка-свободные аминокислоты»

Так как вторые производные спектров поглощения аддитивных моделей различных белков демонстрируют сходство (см. 3.2), то для качественной оценки происхождения полос поглощения, как нам представляется, достаточно одной модели.

В этом виде была использована аддитивная модель альбумина (табл. 4 и 5, рис. 24). Дополнительным аргументом являлось наличие в этой белковой макромолекуле дисульфидных связей, отсутствующих у гемоглобина и каталазы. Это позволяет рассмотреть все возможные хромофоры апобелка в заданном диапазоне длин волн.

На рис. 24 представлены вторые производные аддитивного спектра альбумина (DA) и входящих в него парциальных спектров поглощения

Рис. 24. Вторые производные спектров поглощения аддитивной модели альбумина и парциальных спектров поглощения составляющих ее аминокислот

Обозначения: альбумин (Ха), фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W), гистидин (H), цистеин (C), метионин (M), цистин (C2). Вертикальные линии проведены по пикам второй производной аддитивной модели альбумина; знаком «-» и «+» показан вклад аминокислоты в формирование результирующего пика аддитивной модели; по оси ординат — вторая производная поглощения (d A)

Примечание: производные спектров поглощения приведены в одном масштабе, но по ординате смещены друг относительно друга на константу; протокол эксперимента — вариант «C»

аминокислот: фенилаланина (F), тирозина (Y), триптофана (W), гистидина (H), цистеина (C), метионина (M) и цистина (C2). Производная аддитивного спектра (кривая «ХА») получена суммированием производных спектров аминокислот и совпадает со спектром производной, полученной из интегрального аддитивного спектра (исходя из правил дифференцирования).

Из анализа спектров светопоглощения гистидина и серосодержащих аминокислот следует, что данные компоненты не вносят изменений в спектр поглощения аддитивной модели по второй производной. Это объясняется тем, что, во-первых, относительная доля поглощения в аддитивном спектре (240-320 нм) для них незначительна (гистидин, цистеин, метионин; табл. 7), а во-вторых, что более важно, спектры этих аминокислот не имеют пиков поглощения в исходных (недифференцированных) спектрах (цистеин, метионин; рис. 24). Кроме этого, если спектральная полуширина таких пиков, а также ширина областей для точек перегиба слишком велика (гистидин, цистин; рис. 24), то это обстоятельство также не позволяет разрешить тонкую структуру спектров, обусловленных присутствием данных аминокислот. Вероятно, это также справедливо по отношению и к нативным макромолекулам. Так, аналогичная ситуация наблюдалась для гемовой компоненты (см. 3.1).

Как следует из представленных данных (табл. 5, а также табл. 3 и 2, рис. 24), полосы в аддитивном спектре с длинами волн 241,6 (№2), 246,8 (№5), 251,4 (№8), 257,2 (№10,) 260,6 (№11), 263,2 (№12) и 267,0 нм (№13) определяются поглощением аминокислотных остатков фенилаланина. Вклад боковых групп аминокислот тирозина и триптофана в аддитивный спектр поглощения, который оценивается по способности формировать суперпозицию полос (1-13) в этом участке спектра, очень мал. Это обстоятельство связано, прежде всего, со слабой выраженностью или отсутствием пиков поглощения хромофоров этих аминокислот, несмотря на достаточно высокое интегральное значение поглощения (табл. 7). Как уже отмечалось (см. выше), при дифференцировании таких спектров поглощения вторая производная не разрешает их тонкую структуру (исходя из ее свойств).

Таблица 7. Абсолютные интегральные значения (S) и относительные доли (ю, %) поглощения аминокислот в аддитивном (модельном) спектре светопоглощения бычьего сывороточного альбумина в диапазоне длин волн 240-320 нм
Тип аминокислоты Количество

аминокислотных

остатков

S (ю, %)
Фенилаланин 27 95557,3 6,63
Тирозин 20 718541,5 49,87
Триптофан 2 430568,0 29,88
Гистидин 17 695,5 0,05
Цистеин 1 131,4 0,01
Метионин 4 604,8 0,04
Цистин 17 194732,3 13,52

Вместе с тем, формирование полос в аддитивном спектре зависит также и от соотношения интенсивностей поглощения боковых групп аминокислот.

Полоса поглощения может быть сформирована в результате возникновения определенной суперпозиции светопоглощения аминокислот, даже если их спектры (или участки спектров) монотонны, т.е. без экстремумов. При этом, результирующий пик, соответствующий определенному пику боковой группы некоторой аминокислоты из-за наложения монотонных участков спектра других аминокислотных остатков макромолекулы, может быть усилен, ослаблен или смещен [41].

Так, для пика аддитивной модели БСА (Х=241,6 нм) отмечается его некоторое смещение и незначительное снижение интенсивности относительно пика фенилаланина (241,2 нм) (область «а» на рис. 24, рис. 25-а), что обусловлено вкладом составляющей тирозина. Несмотря на постоянное по абсциссе значение этого пика (№2) в аддитивных моделях белков (с различным отношением фенилаланин/тирозин, табл. 5), для вторых производных спектров поглощения нативных белков, его положение несколько меняется (табл. 2 и 3). Это может указывать на разность хода при «красным» волновом сдвиге для фенилаланина и

Рис. 25. Вторые производные аддитивного спектра альбумина и входящих в него парциальных спектров поглощения аминокислот: фенилаланина и тирозина

Обозначения: аддитивный спектр альбумина (LA), парциальные спектры фенилаланина (F) и тирозина (Y); по оси ординат — вторая производная поглощения (d2A); пунктиром и знаком «*» отмечены возможные полосы поглощения; контурные стрелки показывают направление вклада тех или иных боковых групп аминокислот в формирование суперпозиции соответствующей результирующей полосы

Примечание: производные приведенных спектров поглощения смещены друг относительно друга по оси ординат на константу; в аддитивную модель также входят парциальные спектры поглощения триптофана, гистидина, цистеина, метионина и цистина; протокол эксперимента — вариант «С»

тирозина в нативном белке относительно модели и зависящем от микроокружения хромофоров этих аминокислот.

Кроме этого, пик аддитивной модели альбумина с Х=267,0 нм (наряду с его формированием фенилаланином), по-видимому, определяется отчасти плохо разрешенной полосой тирозина с большой полушириной пика и с близким значением длины волны как у фенилаланина (область «б» на рис. 24, рис. 25-б).

Однако для вторых производных спектров поглощения белков этот пик (полоса №13) из-за минимального вклада составляющей тирозина будет варьировать несущественно, а наблюдаемые девиации (табл. 2 и 3), вероятно, связаны со случайной ошибкой.

Возможная полоса №14 (для аддитивных моделей белков — 268,6 нм), вероятно, формируется как суперпозиция плохо разрешенных локальных неоднородностей фенилаланина и тирозина (рис. 25-б).

Следует отметить, что пики полос №5, №8, №10, №11, №12 и №13 вторых производных спектров поглощения нативных белков меняют свое положение незначительно, в пределах ошибки (табл. 2 и 3), что хорошо согласуется с аддитивной моделью (в частности, альбумина). Так, в этой области формирование полос поглощения принадлежит исключительно аминокислотным остаткам фенилаланина (или главным образом фенилаланина — полоса №13). Соответственно, отклонения по абсциссе пиков этих полос, обусловленные разностью волнового сдвига различных по типу аминокислотных остатков, отсутствуют.

В связи с этим, данные пики полос могут быть использованы как калибровочные, для компенсации систематических ошибок по точности установки длины волны при исследовании спектров белков (рис. 19, например, пик полосы №10).

Пики второй производной спектра поглощения белков, отмеченные ранее как «возможные пики полос поглощения» (№3, №4, №6, №7 и №9), попадают в область, где они могут быть сформированы практически только аминокислотными остатками фенилаланина. Следовательно, если эти пики не являются систематической ошибкой, то они обязаны своим происхождением данной аминокислоте.

Для убеждения в такой версии мы сравнили вторые производные спектров поглощения оксигемоглобина F и фенилаланина.

Чтобы исключить систематическую ошибку, интерпретируемую как пик второй производной в спектре поглощения фенилаланина, дополнительно использовали альтернативный протокол эксперимента (D) (табл. 8).
Таблица 8. Протоколы экспериментов
Параметр Вариант
C D
pH-метр S20-K Seven Easy Hanna 211
Натрий- фосфатный буфер (производитель реагентов) PanEco Sigma-Aldrich
Молярность буфера, моль/л 0,01 0,1
Спектрофотометр Shimadzu-

2550(PC)

Shimadzu-

2401(PC)

Скорость сканирования Slow Very Slow
Фильтрация шумов KBLF SGSF
Фенилаланин (производитель) PanEco Ajinomoto

Примечание: приведены протоколы только в тех позициях, где существуют различия между ними

Как следует из представленных данных (рис. 26, кривая 1 и 2), вторые производные спектров поглощения фенилаланина, полученные по разным протоколам эксперимента, находятся в хорошем соответствии друг с другом. Связь между плохо разрешенными полосами поглощения, обозначенными как «возможные» также хорошо прослеживается (рис. 19). Степень выраженности пиков для образцов фенилаланина и некоторое их варьирование по оси абсцисс определяются, в первую очередь, как неизбежными артефактами используемых алгоритмов сглаживания, так и уровнем фильтрации сигнала в пределах каждого из этих алгоритмов.

Сравнение вторых производных спектров поглощения гембелка и

Рис. 26. Вторые производные спектров поглощения оксигемоглобина F и фенилаланина

Обозначения: фенилаланин (1) и (2), оксигемоглобин (3); по оси ординат — вторая производная поглощения (d A)

Примечание: производные приведенных спектров поглощения нормированы по амплитуде и смещены друг относительно друга по оси ординат на константу; протокол эксперимента для оксигемоглобина — вариант «B», фенилаланина (1) — «D», фенилаланина (2) — «C»

фенилаланина позволяет отклонить версию, что полосы №3, №4, №6, №7 и №9 являются только лишь систематическими ошибками спектров поглощения образцов.

Следовательно, таким способом стало возможным подтвердить наличие пиков с указанными номерами полос поглощения и установить их происхождение. Однако использование данных пиков в качестве реперных точек в целях исследования изменения волнового сдвига и/или интенсивности этих пиков при изменении микроокружения хромофоров из-за очень слабого и плохо разрешенного сигнала представляется весьма затруднительным.

Несоотнесенная полоса с номером 1 (для нативного альбумина — 242,2 нм), также, вероятно, обусловлена поглощением аминокислотных остатков фенилаланина с длиной волны менее 240 нм (ориентировочно на -3 нм относительно текущего).

Возможно, положение этой полосы в некоторой степени зависит и от тирозиновых остатков в молекуле нативного белка, аналогично соотнесенной полосе №2.

Сопоставляя пик полосы №14 по вторым производным спектров поглощения фенилаланина, полученных по разным протоколам эксперимента, подтвердить его происхождение не удалось из-за наличия вместо пика слабо выраженной точки перегиба в контрольном спектре фенилаланина (D). Вероятно, этот пик может быть обусловлен как поглощением тирозина, так и возникшей систематической ошибкой. Тем не менее, во вторых производных спектров поглощения белков данному пику в аддитивной модели можно соотнести пик в области 270,6^271,8 нм.

Таким образом, с помощью аддитивной модели нами были проанализированы полосы поглощения с порядковыми номерами от 1 до 14 для некоторых нативных белков, а именно их апобелковой компоненты в диапазоне длин волн 240-269 нм.

Как следует из диаграммы (рис. 19), пики полос поглощения с номерами 15-20 характеризуются большей вариабельностью в положении по оси длин волн относительно рассмотренных ранее (1-14). Более высокая лабильность пиков полос поглощения №3, №4, №6, №7, №9 в местоположении по оси абсцисс относительно более выраженных по амплитуде пиков фенилаланина (полосы: №5, №8, №10, №11, №12 и №13) объясняется влиянием случайных ошибок.

Однако для полос с номерами 15-20, кроме случайных ошибок в случае низкоамплитудных сигналов, варьирование положения пиков может быть обусловлено их характерной суперпозицией по второй производной спектров поглощения тирозина и триптофана, а также фенилаланина (полосы №15 и № 16), при этом их экстремумы могут находиться в противофазе, нивелируя результирующий пик (область «в» на рис. 24, рис. 27) [41].

Различное соотношение парциальных спектров поглощения тирозина и триптофана вызывает уже в аддитивных моделях белков изменение положения результирующих полос (рис. 21, табл. 5). Для спектров поглощения нативных белков, из-за относительно высокой лабильности спектров светопоглощения триптофановых и особенно тирозиновых остатков аминокислот, с изменением их микроокружения такие вариации станут еще более ощутимыми (рис. 19) [41].

Как следует из представленных данных (рис. 27), на второй производной аддитивного спектра поглощения альбумина обнаруживаются слабо разрешенные пики с длиной волны 269,8 и 271,4 нм (полосы №15 и №16). Несмотря на достаточно низкую выраженность этих пиков, в спектре поглощения альбумина им можно сопоставить значения: 273,6 и 274,4 нм, и, вероятно, 277,2 нм. Эти пики представляют собой суперпозицию поглощения боковых групп фенилаланина, тирозина и триптофана. Плохая выраженность (и обособленность) пиков этих полос поглощения друг относительно друга определяется достаточно высоким отношением Y/W (10,00) для БСА (табл. 6).

Например, для спектров поглощения нативного оксигемоглобина A и F эти полосы (№15: 273,2 и 273,8 нм и №16: 275,0 и 275,2 нм, табл. 2) выглядят более изолированно из-за снижения отношения Y/W до 2,00 и 1,25 соответственно (рис. 21 и табл. 6).

Пик с длиной волны 269,8 нм на второй производной аддитивного спектра

Рис. 27. Вторые производные аддитивного спектра альбумина и входящих в него парциальных спектров поглощения аминокислот: фенилаланина, тирозина и триптофана

Обозначения: альбумин (LA), фенилаланин (F), тирозин (Y) и триптофан (W); по оси ординат — вторая производная поглощения (d A); контурные стрелки показывают направление вклада тех или иных боковых групп аминокислот в формирование суперпозиции соответствующей результирующей полосы

Примечание: производные приведенных спектров поглощения смещены друг относительно друга по оси ординат на константу; в аддитивную модель также входят парциальные спектры поглощения гистидина, цистеина, метионина и цистина; протокол эксперимента — вариант «C»

поглощения альбумина, как нам представляется, формируется следующим образом (рис. 27). На слабовыраженный размытый пик триптофана с А=271,6 нм (т.е. на его область) накладывается локальный минимум тирозина (269,6 нм). Однако на длине волны 269,8 нм у фенилаланина также наблюдается плохо разрешенный пик. Этот пик обеспечивает выраженность рассматриваемой суперпозиции (269,8 нм) за счет последовательной (от триптофана) компенсации локального минимума тирозина по его «интенсивности»» и положению. При этом сам пик фенилаланина (269,8 нм) в аддитивном спектре несколько вырождается. Так, на второй производной аддитивного спектра поглощения трипсина из-за низкого содержания фенилаланина данный пик (269,8 нм) не проявляется (рис. 21 и табл. 5).

Естественно, что анализируемая очередность шагов формирования полосы с Х=269,8 нм условна, т.к. процесс образования пиков синхронен, а использованный порядок анализа определялся, в основном, величиной абсолютного поглощения тех или иных боковых групп аминокислот по степени убывания их интенсивности поглощения в дифференцированном спектре.

Формирование полосы поглощения с длиной волны 271,4 нм может быть таким. Пик фенилаланина с А=271,2 нм, а также его возможный сателлит (локальная неоднородность: 272,4 нм), усиленные размытым пиком триптофана (271,6 нм), задают пик (271,4 нм). Локальные неоднородности тирозина (точки перегиба: 271,0 и 272,4 нм), по-видимому, несколько увеличивают разрешение пика в аддитивной модели альбумина. Некоторый локальный минимум фенилаланина (273,4 нм), в совокупности с разнонаправленными изменениями интенсивности поглощения, представленной по второй производной триптофана и тирозина, делают эту полосу более контрастной.

Для спектров поглощения альбумина принимаем во внимание волновые сдвиги хромофоров боковых групп аминокислот, а также их неоднородность в силу целого ряда причин [23]. Однако хорошее соответствие спектров исследуемого белка и его аддитивной модели, позволяет, как нам кажется, успешно перенести полученные результаты интерпретации формирования пиков 269,8 и 271,4 нм на исходный (моделируемый) спектр с поправками на волновой сдвиг и интенсивность пиков этих полос поглощения.

Следует отметить, что, в целом, для вторых производных спектров поглощения белков положение полосы №15, и в большей степени — №16, достаточно вариабельно (рис. 19). Это обусловлено как слабой выраженностью этих полос, так и их высокой зависимостью от соотношения аминокислотных остатков фенилаланина, тирозина и триптофана, а также особенностями микроокружения хромофоров боковых групп данных аминокислот. Характерно следующее: для аддитивных моделей спектров поглощения белков положение полосы №15 практически не меняется, а степень варьирования полосы №16 меньше, чем у спектров поглощения нативных белков, что подтверждает роль микроокружения радикалов аминокислот в составе макромолекулы.

Следующий пик с Х=274,2 нм (полоса №17) представляет собой суперпозицию восходящих к экстремумам для тирозина (275,2 нм) и нисходящих для триптофана (275,0 нм) участков спектра. Аналогично предыдущим полосам поглощения (№15 и №16), для нативных белков положение данного результирующего пика варьирует в большей степени, чем для аддитивных спектров (рис. 19, табл. 5).

Полоса №18 (для аддитивной модели альбумина — 275,4 нм) представляет собой суперпозицию пика полосы поглощения тирозина (275,2 нм) и диффузного, но достаточно выраженного минимума триптофана, который находится между размытыми пиками по второй производной спектра поглощения последнего (271,6 и 277,6 нм). В результате пик поглощения тирозина, кроме снижения своей интенсивности, становится несколько диффузным, приобретая качества локальной области поглощения триптофана. Очевидно, что выраженный, но размытый минимум триптофана в этой области не приводит к сколь-нибудь значимому смещению положения результирующего пика. Поглощением аминокислотных остатков фенилаланина в области 274-320 нм можно пренебречь, из-за его крайне низкой величины S и, соответственно, ю, %.

Положение данной полосы по оси абсцисс максимально вариабельно относительно других, как ранее рассмотренных (2-17), так и последующих анализируемых полос поглощения (см. далее). Это свойство позволяет использовать пик полосы №18 в качестве маркера при оценке характера микроокружения боковых групп тирозина. Кроме этого, существенное варьирование интенсивности данной полосы по второй производной спектра поглощения позволяет использовать ее пик и при оценке отношения количества боковых групп тирозина к триптофану.

Полоса с Х=282,2 нм возникает в результате сложения полос поглощения тирозина (282,4 нм) и триптофана (281,6 нм). Результирующая полоса (№19) приобретает при этом форму, близкую к форме полосы поглощения тирозина, но выражена несколько более интенсивно, чем полоса последнего.

Пик поглощения 289,2 нм (полоса №20) является результирующей полосы триптофана (288,8 нм) и приходящейся на эту полосу несимметричной областью с минимумом поглощения тирозина при 288,0 нм. Суперпозиция сохраняет форму полосы поглощения триптофана с некоторым смещением последней, но выражена менее интенсивно.

Разнонаправленный вклад тирозина и триптофана в результирующие полосы 18-20, и особенно выраженные по интенсивности полосы №19 и №20 позволяют их использовать в оценке соотношения количества аминокислотных остатков тирозина к триптофану (табл. 6, рис. 22 и 23). Примечателен тот факт, что для вторых производных аддитивных спектров поглощения варьирование полос поглощения 19-20 по оси абсцисс незначительно (рис. 21, табл. 5). Это позволяет задействовать пики поглощения данных полос в аддитивных спектрах как реперные точки при анализе особенностей микроокружения аминокислотных остатков тирозина и триптофана при их различных соотношениях в составе нативной макромолекулы.

Высокое разрешение и интенсивность пиков полос поглощения №19 и №20 минимизируют вклад случайных ошибок в девиацию положения их экстремумов по оси длин волн. Из этого следует, что такие ошибки для высокоинтенсивных полос, где наблюдается варьирование их местоположения, не

являются определяющими.

Следовательно, используя аддитивную модель, можно с достаточно хорошей степенью приближения проанализировать выявленные плохо разрешенные полосы в спектре поглощения нативного белка на предмет особенностей формирования их составляющими полосами поглощения боковых групп аминокислот.

Обнаружение большинства пиков поглощения фенилаланина в составе молекулы белка представляет собой сравнительно простую задачу в силу хорошей выраженности полос, которые почти не перекрываются с полосами поглощения других аминокислот.

Перекрытие полос поглощения и локальных минимумов тирозина и триптофана формирует области, суперпозиция полос которых зависит от соотношения данных аминокислотных остатков, если рассматривать это применительно к различным белкам. Учитывая, что боковые группы тирозина и триптофана относительно групп фенилаланина в большей степени подвержены возмущениям микроокружения среды, это еще больше затрудняет обнаружение, идентификацию и анализ таких полос, особенно в диапазоне длин волн 268—276 нм, где наблюдается суперпозиция их поглощения для рассматриваемых аминокислот.

Таким образом, из 20 полос, зафиксированных по вторым производным спектров поглощения белков и их моделей, только полоса с №14 был отмечена как «возможная». И хотя другая полоса (№1) не был соотнесена к полосе в аддитивной модели из-за ограничения по выбранному диапазону длин волн, тем не менее, вероятно, его возникновение связано с поглощением одного из пиков фенилаланина (в аддитивной модели), лежащего в области 238-240 нм.

При анализе формирования суперпозиции пиков полос поглощения представляется удобным в графиках-схемах указывать направления изменений в спектре поглощения с помощью стрелок-векторов. В принципе, определяя, кроме направления, еще и величину такого вектора, можно будет использовать в перспективе и аппарат линейной алгебры.

<< | >>
Источник: Лавриненко Игорь Андреевич. РАЗРЕШЕНИЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ПЕРЕКРЫВАЮЩИХСЯ ПОЛОС ПОГЛОЩЕНИЯ ХРОМОФОРОВ НЕКОТОРЫХ ПРОСТЫХ И СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ В ДИАПАЗОНЕ ДЛИН ВОЛН 240-320 НМ. 2015

Еще по теме 3.3 Идентификация полос поглощения в спектрах белков путем их сопоставления в системе «аддитивная модель апобелка-свободные аминокислоты»:

  1. ВВЕДЕНИЕ
  2. 3.3 Идентификация полос поглощения в спектрах белков путем их сопоставления в системе «аддитивная модель апобелка-свободные аминокислоты»
  3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ