<<
>>

5.2 Исследование УФ-спектров поглощения простетических групп окси-, карбокси-, дезокси- и метгемоглобина

Как уже отмечалось (см. 3.1), исследование полос поглощения, принадлежащих хромофорам боковых групп аминокислот с помощью второй производной в интегральных спектрах светопоглощения гемоглобина большой трудности не представляет.

Решение такой задачи облегчается тем, что гемовая компонента не содержит пиков поглощения, которые имеют малую спектральную полуширину (как например, у фенилаланина, тирозина или триптофана), и которые могли бы непосредственно и значимо искажать спектр поглощения апобелка. Естественно, такая «оптическая прозрачность» простетических групп гемоглобина как раз и затрудняет исследование последних.

Разложением интегрального спектра светопоглощения гембелка было подтверждено наличие некоторых размытых пиков поглощения небелковой компоненты для окси- и карбоксиформ биомакромолекулы (см. 4.2, рис. 39 и 40).

Однако тонкая структура спектров поглощения гемовой составляющей остается невыясненной. Поиск плохо разрешенных полос поглощения для небелковой части макромолекулы, кроме вышеназванной проблемы, осложняется неизбежным присутствием стохастического шума в спектрах, который сильно осложняет обнаружение пиков с широкой полосой светопоглощения.

Возможным способом анализа тонкой структуры спектра поглощения небелковой компоненты макромолекулы могло быть следующее: модельный спектр простетических групп, т.е. В\ (рис. 56, кривая 1) дифференцируется по второй производной (кривая 2), далее выполняется сглаживание этой производной спектра с помощью полинома/сплайна (кривая 3).

Однако из-за наличия в модельном спектре (кривая 1) артефактов, обусловленных «следовым» присутствием полос поглощения хромофоров боковых групп аминокислот (см. 4.1), на второй производной спектра светопоглощения такие «следы», соответственно, наблюдаются наиболее отчетливо (кривая 2). Сглаживание дифференцированного спектра с целью подавления этих узкополосных пиков желаемого результата не дает (кривая 3).

Вместе с тем, предложенный нами способ разложения интегрального спектра поглощения гембелка содержит этап (№10, см. 4.1), на котором выполняется аппроксимация спектра В1 полиномом. Фактически осуществляется фильтрация высоких частот этого спектра. Такие частоты представляют собой как стохастический шум в виде узкополосных пиков, так и сами пики-артефакты от поглощения хромофоров боковых групп аминокислот с малой спектральной полушириной. Происхождение последних связано, как уже отмечалось, с неоднородностью волнового сдвига различных по своему типу аминокислотных остатков. Дифференцированная по второй производной аппроксимация В1 (она же — модель спектра поглощения гемовой компоненты — B) позволяет разрешить тонкую структуру спектра (рис. 57).

Вторая производная спектра поглощения небелковой составляющей также может быть представлена как разность между соответствующими производными интегрального спектра поглощения и спектра апобелка гемоглобина (исходя из

Рис. 56. Модель спектра поглощения небелковой компоненты

карбоксигемоглобина

Обозначения: модель спектра поглощения небелковой компоненты как разность (B\) между интегральным спектром макромолекулы (C) и смещенным по оси абсцисс модельным спектром ее апобелка (Л\) (1), вторая производная модельного спектра поглощения B\ (2) и аппроксимация полиномом Чебышева спектра поглощения по второй производной (3); е — молярный показатель поглощения; d е — вторая производная молярного показателя поглощения

Примечание: протокол эксперимента — вариант «B»

Рис. 57. Вторые производные моделей спектров поглощения простетических групп гемоглобина

Обозначения: дезоксигемоглобин A (1), метгемоглобин A (2), оксигемоглобин F (3), оксигемоглобин A (4) и карбоксигемоглобин A (5); «-а» и «-в» — анализируемые области спектра; по оси ординат — поглощение (A)

Примечание: модели спектров поглощения смещены друг

относительно друга по оси ординат на константу; протокол эксперимента — вариант «В»

правил дифференцирования, рис.

36). Причем, простое сопоставление вторых производных интегрального спектра поглощения (кривая 1) и его апобелковой компоненты (кривая 2), не позволяет выявить плохо разрешенные пики поглощения гемовой части данного белка.

На рис. 57 показаны вторые производные модельных спектров поглощения небелковой составляющей макромолекулы гемоглобина: дезоксигемоглобина A (кривая 1), метгемоглобина A (кривая 2), оксигемоглобина F (кривая 3), оксигемоглобина A (кривая 4) и карбоксигемоглобина A (кривая 5).

На всех производных спектров светопоглощения отмечаются две полосы, которые можно временно обозначить как №1 и №2, или лучше, чтобы избежать путаницы с нумерацией полос апобелка (№№1-20), как «-а» и «-р». Положение пиков этих полос по оси длин волн представлено в табл. 12.

Таблица 12. Положение некоторых пиков в исходных и дифференцированных по второй производной спектрах поглощения простетических групп
Дериваты гемоглобина Значение положения пиков поглощения по абсциссе, нм
Полосы УФ-диапазона Полосы видимого диапазона
«-а» «-Р» Р а
A d2A A d2A A d2A A d2A
Оксигемоглобин A 269,2 268,0 — 289,2 541,6 543,4 576,6 577,8
Карбоксигемоглобин A 266,4 266,6 — 291,4 538,6 538,4 568,8 570,6
Дезоксигемоглобин A — 263,2 — 290,0 554,8* 551,2 — 587,4
Метгемоглобин A — 267,8 — 290,6 — 543,0 575,8 578,6
Оксигемоглобин F 268,6 267,6 — 288,2 541,4 + 576,4 +

2

Примечание: исходный (A) и дифференцированный (d A) спектр; вычисленные («-а» и «-в») и регистрируемые (а и в) — полосы поглощения простетических групп; «*» — для дезоксигемоглобина пик с А555 [17] традиционно относят к а- полосе; по абсциссе: длина волны, выраженная в нанометрах (нм); в УФ- диапазоне (в отличие от видимого) значения положения пиков получены из модели спектра поглощения гемовой компонент; все измерения положения пиков выполнены по данным, полученными в ходе наших экспериментов; « + » — данные не представлены; «—» — пики не определены

Из представленных данных (табл.

12) видно, что для окси- и карбоксигемоглобина значения положения пиков полос поглощения, полученных по шкалам A и d A, хорошо соотносятся друг с другом. Возможное несовпадение пиков для той или иной производной гемоглобина обусловлено различающимися способами их определения (т.е., по A и d A), что рассматривалось нами ранее (см. 2.2.9, рис. 6 и 7).

Тогда, по отношению к пику полосы «-а» для дезокси- и метгемоглобина, возникает вопрос: «Это артефакт различных математических преобразований и допущений или это действительно пик поглощения?».

В пользу версии о существовании «-а»-полосы говорит высокая скоррелированность модельных спектров поглощения производных гембелка к спектрам нативных макромолекул (см. 4.2, рис. 44).

Как было показано ранее (см. 3.1 и 5.1), в диапазоне длин волн от 270 нм и менее во вторых производных спектров поглощения дериватов гемоглобина как для нативных макромолекул (рис. 10-13, 54), так и для моделей апобелка, сколько-нибудь значимых изменений не происходит. Однако для моделей небелковой составляющей положение пика дезоксигемоглобина (263,2 нм) отстоит достаточно далеко от аналогичного пика метгемоглобина (267,8 нм), но пик метгемоглобина близок по своему положению к таковым для окси- (268,0 нм) и карбоксигемоглобина (266,6 нм) (рис. 57). Это, в свою очередь, хорошо соотносится с представлениями об особенностях лигандирования гемового железа [18], а также результатам наших вычислений по данным PDB (табл. 11).

Сложнее дело обстоит с «-р»-полосой в части ее подтверждения. Данная полоса обнаруживается только на дифференцированных моделях спектров поглощения небелковой части макромолекулы. Положение этой полосы для всех исследуемых нами гемпроизводных меняется не очень сильно, что несколько настораживает, т.к. ее проекция приходится на область поглощения пиков вторых производных спектра триптофана (прежде всего, полоса №20, рис. 52) и отчасти тирозина.

Положение пика полосы поглощения №20 при изменении степени окисления гемового железа или его лигандировании меняется очень незначительно (табл.

2), что может быть скоррелировано с положением пика «-р»-полосы. Другими словами, возможно, что полоса «-р» — это артефакт от пиков поглощения триптофана (и в некоторой степени тирозина).

В связи с этим, необходимо рассмотреть доступные факты и аргументы, опровергающие или подтверждающие версию существования «-р»-полосы как полосы поглощения гемовой компоненты, а не артефакта, понимание природы которого имеет второстепенное значение.

Для того, чтобы проверить, насколько хорошо определяется и воспроизводится положение того или иного пика поглощения «-р»-полосы в ходе вычислений, нами было проведено сравнение положения последнего по шкале длин волн для вторых производных спектров поглощения оксигемоглобина A и F (т.к. они имеют одинаковое состояние гема при различающейся апобелковой части макромолекулы).

Результат анализа для A и F оксиформ белка показывает некоторую вариабельность в положении «-р»-полос (289,2 против 288,2 нм) относительно «-а»-полос (268,0 против 267,6 нм, табл. 12). Причем, как мы полагаем, эта разница теоретически должна отсутствовать, а фактически — быть в пределах ±0,2 нм (шаг интерполирующей сетки). При этом, из-за размытого характера положения таких пиков и наложения шумовой компоненты, их местоположение может меняться и в больших пределах, что вполне допустимо (см. 4.2). Тем не менее, этот прием не позволил достичь существенного прогресса в оценке статуса данной «-р»-полосы (т.е. насколько вероятно ее существование).

Как уже отмечалось, усугубляет ситуацию тот факт, что положение «-р»- полосы попадает на область поглощения пика триптофана (полоса №20), и этот пик для оксигемоглобина F смещен относительно пика оксигемоглобина A в сторону меньших длин волн (табл. 2), причем коррелирует с положением пика «-р» на второй производной оксигемоглобина A и F (табл. 12).

Для оценки роли пиков поглощения боковых групп аминокислот, как источников потенциальных артефактов, возникающих при разложении интегрального спектра белка, мы сравнили амплитуды вторых производных дериватов гемоглобина (рис.

10-14) в областях «-а» и «-р» полос светопоглощения и сопоставили их с соответствующими интенсивностями данных полос в дифференцированных модельных спектрах простетических групп (рис. 57).

Тогда, для карбоксигемоглобина отношение амплитуд «-а»/«-р» максимально, а для дезоксигемоглобина — минимально (рис. 57). Однако сопоставление амплитуд вторых производных интегральных спектров поглощения гемоглобина, приходящихся своими проекциями на «-а» и «-р» (рис. 10-14), дает следующий ряд: от дезоксигемоглобина A (максимальное

отношение) до оксигемоглобина F (минимальное отношение), что не коррелирует с отношением амплитуд этих полос. И хотя данное сравнение несколько обнадеживает, оно не доказывает существование «-р»-полосы, а только лишь ее допускает.

Для того чтобы оценить, как влияет «следовое» присутствие боковых групп аминокислот в спектре модели небелковой компоненты (51) на формирование и положение пиков вторых производных аппроксимированной модели (т.е., B), нами проведен анализ остатков (Residual), представляющих собой разность B1-B (AB) (рис. 58).

Сопоставляя разностные спектры окси- (кривая 5), карбокси- (кривая 4) и метгемоглобина A (кривая 3) на участке длин волн 255-300 нм, следует отметить их высокое сходство. Тем не менее, у них разнятся полосы поглощения в своем местоположении как «-а», так и «-р». Если бы эти полосы являлись артефактами, то вероятней всего, они бы не различались по своему положению на оси длин волн, т.к. модельный спектр поглощения апобелковой составляющей карбокси-, окси- и метгемоглобина A практически идентичен (рис. 50). В противном случае, мы имели бы дело с одинаковыми модельными спектрами поглощения небелковой составляющей дериватов гемопротеида, т.е. B, однако, это не так (рис. 44).

Так как модельный спектр поглощения (B) небелковой составляющей

Рис. 58. Разность (AB) между моделями Bi и B спектров поглощения небелковой составляющей производных гемоглобина

Обозначения: оксигемоглобин F (1), дезоксигемоглобин A (2), метгемоглобин A (3), карбоксигемоглобин A (4) и оксигемоглобин A (5); маркеры на спектрах указывают проекцию полос поглощения «-а» и «-в»; Yu X — области с высоким артефактом; по оси ординат — поглощение (AA)

Примечание: модели спектров поглощения смещены друг

относительно друга по оси ординат на константу; протокол эксперимента — вариант «В»

оксигемоглобина A (кривая 5) и F (кривая 1), в т.ч., и по d A, идентичен (рис. 57), и отличия для этих форм гемоглобина заключаются только в апобелковой части, то тогда другое соотношение аминокислот тирозина и триптофана (табл. 4) вносило бы достаточно значимое изменение в местоположение «-а» и «-р» (рис. 58). Но и это в данном случае не наблюдается.

Большое значение ДВ по оси ординат для оксигемоглобина F относительно аналогичных для других гемпроизводных (область Y, кривая 1), должно было бы сместить полосу «-р» с 288,2 нм в сторону больших длин волн и превысить значение 291,4 нм (HbCO, кривая 4), однако, и это не прослеживается.

На участке длин волн от 255 нм до 285 нм для оксигемоглобинов форм A и F показаны различия (рис. 58, кривая 5 и 1), обусловленные спецификой обработки зарегистрированных спектрофотометром результатов измерений и последующей обработки данных (т.е., эти различия не являются особенностью в поглощении той или иной формы гембелка, и, теоретически, данные спектры должны совпадать). Это обстоятельство позволяет увидеть, что аппроксимация полиномом Чебышева для спектров В1 оксиформ A и F дает очень хорошие результаты по сглаживанию артефактов. Причем результатом такого сглаживания является практически полное совпадение полос поглощения по их местоположению: «-а» — 267,6 нм (оксигемоглобин F) и — 268,0 нм (оксигемоглобин A).

Так как модели спектров поглощения небелковой компоненты дезокси- и метгемоглобина сходны (рис. 44), а их апобелковые составляющие различаются в области от 272,5 нм и более (рис. 50), то становится возможным провести еще одно сопоставление.

Как следует из представленных данных (рис. 58), несмотря на высокое сходство спектров ДВ для HbA (кривая 2) и MtHbA (кривая 3) на участке длин волн 255-270 нм и подобие модельных спектров поглощения для их небелковой компоненты (рис. 44), тем не менее, существуют различия в местоположении «-а»-полос: ДХ=4,6 нм (что достаточно существенно).

Область X в спектре дезоксигемоглобина A (кривая 2) должна приводить к смещению полосы «-р» при аппроксимации полиномом в сторону меньших длин волн. Но фактически ее значение (290,0 нм) даже больше, чем для оксигемоглобина A и F (289,2 и 288,2 нм). Это обстоятельство говорит в пользу существования «-р»-полосы. Причем выбранный способ аппроксимации хорошо «справляется» с присутствующими в спектре В\ артефактами.

Результативность аппроксимации полиномом можно проиллюстрировать на примере карбоксигемоглобина (рис. 59).

Следует также отметить, что сравнительный анализ полос поглощения «-а» и «-р» как системы полос является более эффективным, чем их изучение по отдельности (см. 4.2), и в дальнейшем мы это используем.

Так как аргументов в пользу существования пика полосы «-р», на наш взгляд, не вполне достаточно, была предпринята попытка доказать обратное путем аппроксимации спектра Bi различными полиномами на примере HbCO (рис. 60). В случае сильных расхождений положения «-р»-полосы по второй производной B или ее отсутствия, это давало бы повод усомниться в существовании последней.

Выбор используемых нами полиномов ограничивался главным критерием: величиной r2>99,9 %. Применение полиномов с меньшей величиной этого коэффициента нецелесообразно, т.к. они плохо аппроксимируют на интерполируемом участке спектра и создают дополнительные артефакты.

Из большого многообразия примененных полиномов на рис. 60 представлены только некоторые: Фурье, Чебышева, Ньютона. Причем для этих полиномов приведены только их отдельные порядки.

Как следует из представленных данных, полиномы Чебышева 10 (r2=99,978 %, кривая 1) и 14 (r2=99,983 %, кривая 2) порядков; полиномы Фурье с порядками 6x2 (r2=99,981 %, кривая 4) и 4x2 (r2=99,941 %, кривая 5); степенные полиномы 14 (r2=99,982 %, кривая 3) и 9 (r2=99,913 %, кривая 6) порядков (кроме тестового полинома с r2=99,717 %, кривая 7) показывают, так или иначе, наличие «-р»-полосы.

Ранее отмечалось (см. 5.1), что если хромофор меняет свое поглощение на

Рис. 59. Модель спектра поглощения небелковой компоненты

карбоксигемоглобина A

Обозначения: модель спектра небелковой компоненты В1 (1), аппроксимация полиномом Чебышева, модель B (2), разностный спектр AB, как B-B (3) и вторая производная спектра B (4); е — молярный показатель поглощения; d2e — вторая производная молярного показателя поглощения; Де — разность в показателях молярного поглощения

Примечание: протокол эксперимента — вариант «B»

Рис. 60. Вторые производные моделей спектров поглощения небелковой составляющей карбоксигемоглобина (B), полученных аппроксимацией некоторыми полиномами

Обозначения: полином Чебышева 10 (1) и 14 (2) порядка; полином Фурье, порядок 6*2 (4) и 4*2 (5); степенной полином 14 (3) и 9 (6) порядка (n=1; 2; ...; m); степенной полином (n=0,5; 1,5; ...;4,5)(7); d2e — вторая производная молярного показателя поглощения

Примечание: полином (7) приведен для сравнения, его r =99,7 %; используемый в работе полином, как основной (1) выделен толстой линией; протокол эксперимента — вариант «B»

одном участке спектра, то следует ожидать скоррелированных изменений и на другом его участке. Следовательно, видоизменения в спектре поглощения небелковой компоненты в видимом диапазоне длин волн должны согласованно соотноситься с УФ-диапазоном.

Для этого мы сравнили вторые производные модельных спектров поглощения небелковой части макромолекулы в УФ-диапазоне (где отмечаются «-а»- и «-р»-полосы), со вторыми производными спектров поглощения нативных дериватов гемоглобина (где фиксируются истинные а- и P-полосы поглощения).

Вторые производные были получены как непосредственно из

интегральных спектров поглощения (см. 2.2.9), так и путем дифференцирования

2 2 (d A) аппроксимирующих полиномов Фурье к этим спектрам с r >99,9985 % (рис.

61).

Использование полиномов к исходным спектрам поглощения с их последующим дифференцированием (рис. 61, утолщенные кривые) позволяет более эффективно устранить шумовую компоненту, чем непосредственное дифференцирование (тонкие линии) после применения «стандартной» фильтрации (т.е., принятой в настоящей работе, как основной, см. 2.2.9, рис. 4 и

5) .

Сопоставление d A от аппроксимирующих полиномов к d A, вычисленных «стандартным» способом, позволяет в некоторой степени (из-за ограничений, накладываемых шумом) проверить наличие артефактов при замене исходного спектра таким полиномом.

Как следует из представленных данных (рис. 61), такая замена вполне корректна, полином новых экстремумов в спектр d A не привносит, что позволяет распространить это заключение и на предыдущие аппроксимации (Чебышева и Фурье), использовавшиеся нами в УФ-диапазоне длин волн. Ранее такой тест не мог быть выполнен из-за того, что в УФ-диапазоне происходит перекрытие спектров апобелковой и гемовой компонент макромолекулы.

Из рис. 61 следует, что положения а- и P-полос HbO2 (кривая 3) и MtHb (кривая 2) сопоставимы и коррелируют с аналогичными данными на рис. 57. Для

Рис. 61. Вторые производные спектров поглощения дериватов гемоглобина

Обозначения: тонкие линии — вторые производные спектров поглощения дериватов гемоглобина, толстые линии — вторые производные аппроксимирующих полиномов Фурье (порядок 10*2) к спектрам поглощения этих дериватов; дезоксигемоглобин (1), метгемоглобин (2), оксигемоглобин (3) и карбоксигемоглобин (4); «-а» и «-в» — анализируемые области спектра; d A — вторая производная молярного показателя поглощения

Примечание: вторые производные спектров поглощения смещены друг относительно друга по оси ординат на константу и нормированы по амплитуде k; протокол эксперимента — вариант

«В»

Hb (кривая 1) эти полосы смещены относительно полос HbO2 и MtHb в сторону больших длин волн. В УФ-диапазоне наблюдается некоторое зеркальное отображение по смещению «-а»-полосы. В видимом диапазоне полосы HbCO (кривая 4) смещены относительно полос HbO2 и MtHb в сторону меньших длин волн. В УФ-области — «-р»-полоса смещается зеркально в, а «-а» — также, как и а, смещается в сторону меньших длин волн. То есть, четкой зеркальной, относительно оси ординат, симметрии для полос УФ- и видимого диапазонов длин волн производных гемоглобина по d A не просматривается.

Однако если взять отношение интенсивностей поглощения данных полос по d s как а/р, то такая симметрия видна. Можно сформировать ряд от максимального к минимальному значению а/р: HbCO и HbO2 (а/р>1), MtHb (~1), Hb (

<< | >>
Источник: Лавриненко Игорь Андреевич. РАЗРЕШЕНИЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ПЕРЕКРЫВАЮЩИХСЯ ПОЛОС ПОГЛОЩЕНИЯ ХРОМОФОРОВ НЕКОТОРЫХ ПРОСТЫХ И СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ В ДИАПАЗОНЕ ДЛИН ВОЛН 240-320 НМ. 2015

Еще по теме 5.2 Исследование УФ-спектров поглощения простетических групп окси-, карбокси-, дезокси- и метгемоглобина:

  1. ВВЕДЕНИЕ
  2. 4.2 Разложение УФ-спектров светопоглощения производных гемоглобина на составляющие поглощения апобелка и простетических групп
  3. 5.1 Сравнительный анализ УФ-спектров поглощения апобелковой составляющей окси-, карбокси-, дезокси- и метгемоглобина
  4. 5.2 Исследование УФ-спектров поглощения простетических групп окси-, карбокси-, дезокси- и метгемоглобина
  5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ