<<
>>

3.1 Разрешение полос поглощения в спектрах белков с помощью второй производной

Несмотря на развитие новых методов исследования, молекулярная абсорбционная спектроскопия электронных переходов остается одним из наиболее универсальных, эффективных и доступных методов при анализе как структурных, так и функциональных свойств биомакромолекул [4, 26, 53, 163 ].

С ее помощью накоплены обширные и наиболее существенные результаты о перестройках, происходящих в молекулах белков или их составных частях под влиянием целого ряда физико-химических факторов [4].

Полученные данные, преимущественно, относятся к исследованию спектральных свойств макромолекул в области поглощения боковых групп ароматических аминокислот и свидетельствуют об изменениях в диапазоне длин волн 240-320 нм (Xmax~280 нм [4, 51]). Зачастую эти вариации связываются с разворачиванием/сворачиванием белковой глобулы, сопровождающимся экспонированием/экранированием ее хромофорных групп относительно поверхности белковой макромолекулы [4]. Однако такого рода оценка является малоинформативной и не учитывает вклад отдельных компонент, поскольку, как правило, в ультрафиолетовом (и видимом) диапазонах длин волн спектры поглощения белков, в отличие от атомов и простых молекул, характеризуются широкими перекрывающимися полосами, что существенно затрудняет их интерпретацию.

Увеличение разрешения в этих спектрах можно достичь с помощью дифференцирования, т.е. исследования зависимостей вида: dA/dl!'=f(n)(k), где n — порядок производной. Физический смысл производной заключается в том, что оценивается мгновенная скорость изменения дифференцируемой величины, в данном случае поглощения. Повторное дифференцирование будет означать скорость изменения скорости (ускорения в классической механике) и т.д. Следовательно, производные различных порядков позволяют оценить степень «выраженности изменения» исследуемой величины при ДХ^-0, что дает возможность выявить плохо разрешенные полосы поглощения в макромолекуле.

Для производной первого порядка отсутствие изменений прироста величины обращает ее в ноль, что означает наличие экстремума в исходном спектре. Однако для второй производной эта нулевая точка будет представлять собой экстремум — минимальный прирост величины относительно соседних точек, что соответствует пику поглощения недифференцированного спектра. Дальнейшее увеличение порядка дифференцирования сопряжено с рядом определенных трудностей методического характера [3, 9].

В ходе проведенных экспериментов нами были получены спектры поглощения растворов гемоглобина человека и его производных, спектры поглощения каталазы, выделенной из печени быка, спектры поглощения бычьего сывороточного альбумина и спектры поглощения трипсина, выделенного из поджелудочной железы быка.

Несмотря на принимаемые меры по снижению систематических ошибок при регистрации спектров поглощения (см. 2.2.9), окончательно разрешить эту проблему не представляется возможным. Это обусловлено тем, что такие ошибки возникают на всех этапах исследования: начиная от примесей в той или иной партии реактивов, степени их очистки и аппаратной ошибки при калибровке приборов в серии экспериментов и заканчивая методиками определения концентрации веществ и алгоритмами фильтрации шумов получаемых данных.

В связи с этим, чтобы минимизировать вклад данных ошибок, эксперименты проводились по различным протоколам. Эти протоколы включали в себя позиции, начиная от использования наборов реагентов разных производителей, молярности/ионной силы растворов и концентрации веществ до применения в работе различающихся по серии и типу спектрофотометров, шагу сканирования спектров и последующей обработки результатов измерений. Тем не менее, цель работы не предусматривала исследование спектров поглощения образцов на предмет их воспроизводимости для широкого класса устройств: от полевых приборов до стационарного оборудования исследовательского класса, работающих в различных режимах измерения, а также вариабельности экспериментов по другим показателям.

В табл. 1 приведены протоколы наших исследований только в тех позициях, где существуют различия между ними.
Таблица 1. Протоколы экспериментов
Параметр Вариант
А B C
Образец белка Выделен из крови человека в лаборатории Коммерческий

препарат

Отмывка эритроцитов: изотонический раствор (производитель реагентов) INEOS

Enterprises

PanEco
pH-метр Hanna 211 S20-K Seven Easy
Натрий- фосфатный буфер (производитель реагентов) Sigma-Aldrich PanEco
Молярность буфера, моль/л 0,1 0,01
Спектрофотометр Shimadzu-

2401(PC)

Shimadzu-2550(PC)
Шаг сканирования, нм 0,5 0,2
Фильтрация шумов NURBS KBLF
Определение концентрации белка (метод) Спектрофото­метрически, по системе уравнений Метгемоглобин-

цианидный

Навеска образца в заданном объеме растворителя
Набор аминокислот для создания аддитивной модели белка (производитель реагентов) Ajinomoto PanEco
Определение концентрации аминокислот (метод) Навеска образца в заданном объеме растворителя

На рис.

9 показан спектр поглощения гемоглобина человека (содержащего в основном оксиформу гемоглобина A), в диапазоне длин волн 240-320 нм с ^яш=274,2 нм (кривая 1; n = 6, протокол эксперимента — вариант «А»).

8, d2S,

Рис. 9. Молярный спектр поглощения гемоглобина человека

Обозначения: гемоглобин (1), его вторая производная (2). Здесь и на других аналогичных рисунках: пунктиром и знаком «*» отмечены возможные полосы поглощения; s — молярный показатель поглощения; d2s — вторая производная молярного показателя поглощения

Примечание: протокол эксперимента — вариант «А»

Полученные результаты полностью согласуются с литературными данными [4, 15].

Анализ второй производной этих спектров позволил выявить ряд скрытых полос, обусловленных, прежде всего, поглощением боковых групп ароматических аминокислотных остатков, входящих в состав белковой молекулы (рис. 9, кривая

2) . Кроме установленной с помощью второй производной полосы поглощения с 7^=274,6 нм, нами обнаружено еще 10 плохо разрешенных полос, которые просуммированы в табл. 2 (столбец «Hbtotal»).

Таблица 2. Плохо разрешенные полосы в спектрах поглощения белков, выявленные с помощью второй производной (часть 1)
Полоса, № Длина волны, нм
Hbtotal HbAO2 НЬаСО НЬа MtHbA HbFO2
1 241,0* 240,8* 240,8* 241,2* 241,2* 241,6*
2 243,4 243,0 243,2 242,2 243,0 243,4
3 244,8* 244,4* 244,0* 245,4* 245,0*
4 246,0* 245,4* 245,8* 247,0* 246,8*
5 248,4 247,8 247,8 248,0 248,2 248,6
6 249,8* 250,4* 250,0* 250,2* 250,0*
7 252,0* 252,0* 252,0* 252,2* 252,2*
8 253,2 253,6 253,0 253,2 253,2 253,4
9 255,4* 255,2* 255,6* 255,6* 255,6*
10 258,8 258,6 258,6 258,6 258,8 258,6
11 261,6 261,8 261,6 261,8 261,8 261,8
12 264,8 264,8 264,8 264,6 264,6 264,4
13 268,4 268,6 268,4 268,6 268,4 268,0
14 271,6* 271,8* 271,4* 271,4* 271,2*
15 272,8* 273,2 273,8 273,2 273,4 273,8
16 274,6 275,0 275,4 274,8 274,8 275,2
17 278,2* 278,2 278,8 280,2 278,6 278,0
18 280,0 280,8 280,2 282,4 280,6 279,2
19 284,4 284,4 284,6 285,8 284,4 283,2
20 291,2 291,4 291,2 291,4 291,2 289,8

Примечание: «*» — возможные пики полос поглощения, «—» — пики не

определялись

Для того чтобы выяснить роль гемовой компоненты в формировании пиков второй производной спектров поглощения гембелка в исследуемом диапазоне длин волн нами были изучены спектры светопоглощения оксигемоглобина A, карбоксигемоглобина A, дезоксигемоглобина A и метгемоглобина A.

В такой постановке эксперимента апобелковая компонента макромолекулы постоянна, как минимум, в первичной структуре, что позволяет отследить на начальном этапе сигнал, представляющий собой суперпозицию сигналов от спектра поглощения гема в составе белка и сигналов, обусловленных изменением микроокружения хромофоров боковых групп аминокислот при изменении типа лиганда и/или степени окисления гемового железа.

В этой части исследований был использован вариант «B» протокола эксперимента. Это позволяет контролировать возможные систематические ошибки. Так, если обнаруженные ранее для гемоглобина (табл. 2, «Hbtota1») плохо разрешенные полосы поглощения не выявляются или регистрируются новые, которые прежде не были отмечены, то вероятно имеет место систематическая ошибка, интерпретируемая как плохо разрешенный пик. В то же время, отсутствие тех или иных пиков поглощения может указывать и на очень слабый сигнал, который, в свою очередь, может маскироваться шумовой составляющей в спектрах поглощения.

На недифференцированных спектрах поглощения производные гемоглобина человека характеризуются следующими максимумами: HbAO2 — 274,6 нм; HbACO — 269,0 нм; HbA — 269,0 нм и MtHbA — 268,8 нм (рис. 10-13, кривая 1).

Анализ второй производной полученных спектров гемоглобина ожидаемо показал ряд плохо разрешенных полос (рис. 10-13, кривая 2), которые сведены в табл. 2.

Из представленных данных следует, что вариации гемовой компоненты по типу лиганда и степени окисления гемового железа не оказывают заметного влияния на положение пиков вторых производных спектров поглощения гемоглобина. Таким образом, для второй производной спектры поглощения

8, d2S,

8, d2S,

8, d2S,

8, d2S,

гемовой составляющей в первом приближении «оптически прозрачны».

Это обстоятельство может указывать или на отсутствие полос поглощения гемов вообще, или на их слишком большую спектральную полуширину (размытость). Из-за ограничений, накладываемых шумом в спектре, нахождение таких полос поглощения представляет определенную трудность. Однако с позиции анализа второй производной спектров поглощения апобелковой компоненты, эта особенность позволяет исследовать хромофоры боковых групп аминокислот в составе белка без его разделения на апобелковую и небелковую составляющие.

Следует также отметить, что положение пиков второй производной спектров поглощения по оси абсцисс, в целом, консервативно. Девиации положения пиков связаны как со случайной ошибкой, так и вероятно, с полезным сигналом: изменениями в спектре поглощения гема и спектрах поглощения радикалов боковых групп аминокислот, зависящими от их микроокружения в процессе окисления/восстановления или оксигенации/дезоксигенации молекулы гембелка.

Для оценки степени изменения в положении пиков второй производной спектров поглощения гемоглобина при варьировании аминокислотного состава макромолекулы нами был исследован спектр поглощения оксигемоглобина F. Данный тип гембелка отличается от оксигемоглобина A только апобелковой составляющей в части замены одних аминокислотных остатков другими при их одинаковом количестве в в- и у-цепях (146 остатков). В видимом диапазоне спектры поглощения оксигемоглобина A и F идентичны [170]. Следует ожидать совпадения спектров поглощения их гемовых компонент и в диапазоне длин волн 240-320 нм. Таким образом, система HbAO2/HbFO2 является «инверсной» моделью к системе HbAO2/HbACO/HbA/MtHbA.

На рис. 14 (кривая 1) представлен спектр поглощения оксигемоглобина F с ^тщ=273,6 нм (протокол эксперимента — вариант «В»). Вторая производная спектров поглощения гембелка также показала ряд плохо разрешенных полос (рис. 14, кривая 2), которые представлены в табл. 2.

Замена одних аминокислотных остатков другими вызывает

8, d2S,

соответствующие изменения в положении пиков второй производной в спектре поглощения HbFO2 относительно HbAO2 (№ полосы: 19, 20, табл. 2). Однако положение остальных пиков поглощения второй производной, в целом, сохраняет свою устойчивость.

Из данных также следует, что изменения в апобелковой части молекулы сильнее отражаются на положении пиков второй производной спектров поглощения, нежели изменения в гемовой части. Вероятно, для

дезоксигемоглобина более выраженные отличия в изменении положения пиков второй производной относительно других форм гемоглобина A являются, соответственно, следствием большего изменения в микроокружении хромофоров апобелка, чем для других гемпроизводных биополимера, а не спецификой поглощения света гемом в дезоксиформе (табл. 2, полосы № 18, 19). Эти особенности будут проанализированы в следующих главах.

Представляет интерес, как хорошо могут быть разрешены пики второй производной в спектрах поглощения белков в зависимости от их аминокислотного состава, массовой доли простетических групп и насколько консервативно положение этих пиков.

С этой целью изучены спектры поглощения некоторых простых и сложных белков, являющихся коммерческими продуктами: гемоглобин человека (CAS 9008-02-0, Sigma-Aldrich), каталаза печени быка (CAS 9001-05-2, Sigma-Aldrich), альбумин бычий сывороточный (CAS 9048-46-8, Sigma-Aldrich), трипсин поджелудочной железы быка (CAS 9002-07-7, Sigma-Aldrich). В этой части работы исследования осуществлялись по протоколу эксперимента в варианте «С».

Спектр поглощения гемоглобина человека (содержащего преимущественно окисленную форму, вероятно, различного состава по типу присоединенного лиганда, т.е. MtHb(H2O) и MtHb(OH-) представлен на рис. 15 (^яш=274,4 нм, кривая 1). Спектры поглощения каталазы (Хтш=277,0 нм), альбумина (Xmax=278,6 нм) и трипсина (Xmax=278,6 нм) показаны на рис. 16-18 (кривая 1). Примечателен тот факт, что уменьшение доли гемовой компоненты (каталаза) приводит к смещению максимума поглощения в спектре этого белка в

8, d2S,

Рис. 15. Молярный спектр поглощения гемоглобина (CAS 9008-02-0)

Обозначения: гемоглобин (1), его вторая производная (2) Примечание: протокол эксперимента — вариант «C»

8, d2S,

Рис. 16. Молярный спектр поглощения каталазы (CAS 9001-05-2)

Обозначения: каталаза (1), его вторая производная (2) Примечание: протокол эксперимента — вариант «C»

8, d2S,

Рис. 17. Молярный спектр поглощения альбумина (CAS 9048-46-8)

Обозначения: альбумин (1), его вторая производная (2) Примечание: протокол эксперимента — вариант «C»

8, d2S,

Рис. 18. Молярный спектр поглощения трипсина (CAS 9002-07-7)

Обозначения: трипсин (1), его вторая производная (2) Примечание: протокол эксперимента — вариант «C»

сторону больших длин волн, к значениям пиков поглощения простых белков.

Анализ второй производной полученных спектров белков ожидаемо показал ряд скрытых полос поглощения (рис. 15-18, кривая 2, табл. 3).

Таблица 3. Плохо разрешенные полосы в спектрах поглощения белков, выявленные с помощью второй производной (часть 2)
Длина волны, нм
Полоса, № Г емоглобин, CAS 9008-02-0 Каталаза, CAS 9001-05-2 Альбумин, CAS 9048-46-8 Трипсин, CAS 9002-07-7
1 242,0* 242,2* 242,2* 242,2*
2 243,6 243,8 243,0 243,4*
3 244,8* 244,4* 244,8* 244,8*
4 246,2* 247,0* 245,8* 247,0*
5 247,6 248,4 247,6 248,8
6 250,8* 250,2* 249,6* 250,8*
7 252,2*
8 253,0 253,0 253,0 252,8
9 255,4* 255,6* 255,2* 254,2*
10 258,8 258,6 258,6 258,4
11 261,6 261,4 261,4 261,2
12 264,6 264,8 264,6 263,2*

265,0

13 268,6 268,2 268,4 268,0
14 270,8* 270,6*

272,2*

271,0* 271,2*
15 274,0 273,8* 273,6 274,0
275,0 274,4*
16 276,8 277,0 277,2 277,0
17 278,6 278,8 278,8*
18 279,8 279,4 282,0* 279,8
19 284,4 284,6 286,0 284,2
20 291,4 291,6 291,2 291,2

Примечание: «*» — возможные пики полос поглощения, «—» — пики не

определялись

На рис. 19 показаны области поглощения гомологичных пиков второй

Рис. 19. Диаграмма расположения областей, в которых наблюдаются гомологичные пики вторых производных спектров

поглощения белков

Обозначения: по оси ординат — номер полосы поглощения в соответствии с табл. 3 и 4; «*» — области с возможными полосами поглощения

производной спектров белков. Сформированные области представляют собой интервал между наименьшим и наибольшим значением (по оси абсцисс) гомологичных пиков для всех изучаемых нами белков.

В данном случае использование крайних членов вариационного ряда позволяет наиболее строго указать диапазон варьирования положения соответствующего пика.

Применение таких статистических показателей как средние величины, ошибка средней, стандартное отклонение и доверительный интервал потребует, с одной стороны, проведение дополнительных избыточных оценок (однородность и равенство выборки, тест на нормальность распределения и т.д.), с другой — сужает искомую область, и поэтому нецелесообразно.

Наличие подобных устойчивых обособленных областей пиков вторых производных позволяет осуществлять прогноз положения данных максимумов, вероятно, для всех белков, а аномалии в их расположении могут представлять дополнительный интерес при изучении макромолекул. С другой стороны, в рамках проведенного исследования, такие зоны также позволяют выполнять самоконтроль, сузить поиск и облегчают дифференцировку полезного сигнала относительно случайных и систематических ошибок, как например, в случае со второй производной спектра поглощения трипсина в области 240-270 нм, где такой сигнал слабо выражен. Варьирование АХ для этих областей может указывать как на различные соотношения типов боковых групп аминокислот, так и на изменение их микроокружения.

Таким образом, по второй производной удалось выявить в общей сложности 20 пиков, которые ассоциированы с полосами поглощения в спектрах белков. Вместе с тем на данном этапе некоторые пики, отмеченные как «возможные», дифференцировать относительно систематических ошибок не удалось. Для того чтобы снять эту неопределенность, в дальнейшем потребуется проведение дополнительных тестов (см. 3.2).

<< | >>
Источник: Лавриненко Игорь Андреевич. РАЗРЕШЕНИЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ПЕРЕКРЫВАЮЩИХСЯ ПОЛОС ПОГЛОЩЕНИЯ ХРОМОФОРОВ НЕКОТОРЫХ ПРОСТЫХ И СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ В ДИАПАЗОНЕ ДЛИН ВОЛН 240-320 НМ. 2015

Еще по теме 3.1 Разрешение полос поглощения в спектрах белков с помощью второй производной:

  1. ВВЕДЕНИЕ
  2. 3.1 Разрешение полос поглощения в спектрах белков с помощью второй производной
  3. 3.2 Соотнесение полос поглощения в спектрах белков к полосам поглощения в спектрах аддитивных моделей
  4. 3.3 Идентификация полос поглощения в спектрах белков путем их сопоставления в системе «аддитивная модель апобелка-свободные аминокислоты»
  5. 5.2 Исследование УФ-спектров поглощения простетических групп окси-, карбокси-, дезокси- и метгемоглобина
  6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ