<<
>>

3.2 Соотнесение полос поглощения в спектрах белков к полосам поглощения в спектрах аддитивных моделей

Очевидным решением в установлении происхождения полос в спектрах поглощения белков может быть их сопоставление с таковыми для хромофоров боковых групп свободных аминокислот, входящих своими остатками в состав макромолекулы [23].

Однако это не совсем корректно. Суперпозиция поглощения аминокислотных остатков формирует некоторое подобие интерференционной картины. Так, в крайних случаях, наблюдаемые полосы поглощения в белке могут отсутствовать в спектрах светопоглощения отдельно взятых аминокислот, или полосы поглощения этих аминокислот могут быть нивелированы локальными минимумами в макромолекуле. Кроме этого, возможна масса комбинаций, когда полосы поглощения в белке могут быть смещены по абсциссе относительно таковых для свободных аминокислот.

Одним из возможных путей в идентификации полос поглощения белков является сравнительный анализ спектра светопоглощения раствора биополимера и аддитивного спектра, полученного в результате суммирования парциальных спектров растворов аминокислот, входящих в состав макромолекулы. Очевидно, что при этом не учитываются наличие внутримолекулярных связей, полярность локального окружения, расположение боковых групп в молекуле белка и т. д.

Тем не менее, такой подход позволяет более корректно установить происхождение полос поглощения в молекуле белка, относительно сравнения по отдельным свободным аминокислотам, а также дает возможность использовать модельный спектр в качестве базового при анализе особенностей микроокружения экспонированных аминокислотных остатков макромолекулы и оценки их приблизительного количества.

Таким образом, при идентификации полос поглощения в спектрах белков в наших исследованиях первым шагом стало сопоставление пиков второй производной в спектрах светопоглощения макромолекул и их аддитивных

моделей.

Так как существуют вполне определенные устойчивые области пиков поглощения второй производной спектров белков (рис.

19), то для сопоставления спектров нативных макромолекул и их моделей достаточно биополимера одноготипа. Для этих целей был использован спектр поглощения гемоглобина человека (рис. 9, 20 кривая 2), к которому была построена его аддитивная модель по апобелку (рис. 20, кривая 1, протокол эксперимента — вариант «A»).

Исходная модель спектра поглощения апогемоглобина получена путем сложения парциальных спектров молярного поглощения фенилаланина (F), тирозина (Y), триптофана (W), гистидина (H), цистеина (C) и метионина (M) в соотношении 30:12:6:38:6:6 по данным аминокислотного состава этого белка (PDB 1BZ0) [144].

Как следует из представленных данных (рис. 20), пики второй производной спектра поглощения нативного гемоглобина находятся в хорошем соответствии с таковыми для аддитивной модели по критериям: форма, относительные соотношения их амплитуды и положения. Для пиков нативного гемоглобина характерен положительный волновой сдвиг относительно модельного спектра, что хорошо соотносится с теоретическими представлениями [28].

Аномалий в положении пиков нативного гемоглобина относительно модели не обнаружено. Пики, отмеченные как возможные, также имеют положительные сдвиги, а АХ таких сдвигов коррелирует с ближайшими значениями для надежно определяемых максимумов.

В совокупности это не позволяет исключить ненадежно определяемые пики как систематические ошибки. Другими словами, чтобы подтвердить наличие такой ошибки, необходимо отсутствие волнового сдвига между гомологичными пиками в спектре белка и его модели, и что может быть предложено в качестве обратного к указанному тесту (т.е. «от противного»). Кроме этого, предыдущий тест (см. 3.1), который базировался на отсутствии соответствия между гомологичными пиками, находящимися на одной длине волны для спектров

Рис. 20. Вторые производные спектров поглощения гемоглобина и его аддитивной модели по апобелку

Обозначения: гемоглобин (2), его аддитивная модель (1).

Пунктиром и знаком «*» отмечены возможные полосы поглощения; по оси ординат — вторая производная поглощения (d2A)

Примечание: производные спектров поглощения нормированы по амплитуде и смещены друг относительно друга по оси ординат на константу; протокол эксперимента — вариант «A»

нативных белков, полученных по различным протоколам эксперимента, также не разрешил эту неопределенность.

Вместе с тем, хорошая корреляция между исходным и модельным спектром позволяет прогнозировать области, в которых ожидается наличие гомологичного пика, что удобно для его поиска, если он слабо выражен и маскируется шумом (в частности, остатки фенилаланина в молекуле трипсина, см. далее).

Неоднородность волнового сдвига может быть объяснена совокупностью различных по своей природе факторов: случайными ошибками в определении положения пика, неизбежными артефактами фильтрации сигнала, нелинейностью между энергией перехода и длиной волны, различием по типу хромофора (бокового радикала аминокислоты), его микроокружением и т.д.

Так как различные белки характеризуются своим набором отношений аминокислот, отличающихся по типу радикала, то представляет интерес, вопрос о том, как это обстоятельство оказывает влияние на положение пиков вторых производных спектров поглощения. Для этого был проведен «чистый» эксперимент: исследованы аддитивные модели гемоглобинов A и F, каталазы, альбумина и трипсина (рис. 21).

Аддитивные модели были построены исходя из данных аминокислотного состава этих белков, табл. 4 (uniprot.org: гемоглобин — a-цепь P69905, Р-цепь P68871, у-цепь P69891; каталаза — P00432; бычий сывороточный альбумин — P02769; трипсин — P00760) [165].

Как следует из представленных результатов модельного эксперимента (рис. 21, табл. 5), изменение соотношения типов хромофорных групп приводит к некоторому различию в положении пиков по оси абсцисс, особенно в диапазоне 270-295 нм. Причем, это смещение сопровождается выраженным изменением соотношения интенсивности пиков второй производной для данного диапазона.

В спектрах поглощения нативных белков, из-за неодинакового волнового сдвига различающихся по типу хромофоров и различий в микроокружении аминокислотных остатков, изменения по положению (а также амплитуде) пиков

Рис. 21. Вторые производные спектров поглощения аддитивных

моделей белков

Обозначения: гемоглобин A (1), гемоглобин F (2), каталаза (3), альбумин (4) и трипсин (5); вертикальные пунктирные линии проведены по подтвержденным пикам второй производной гемоглобина A; по оси ординат — вторая производная поглощения (d A)

Примечание: производные аддитивных моделей спектров

поглощения нормированы по амплитуде и смещены друг относительно друга по оси ординат на константу; протокол эксперимента — вариант «B/C»

второй производной ожидаются более существенными.

Таблица 4. Аминокислотные составы гемоглобина, каталазы, альбумина и трипсина по типу и количеству хромофоров (боковых групп некоторых аминокислот)
Белок Аминокислотный состав
Гемоглобин Aj 30F 12Y 6W 38H 6C 6M
Г емоглобин F 30F 10Y 8W 34H 4C 8M
Каталаза 124F 84Y 24W 96H 16C 40M
Альбумин (БСА) 27F 20Y 2W 17H 1C 4M 17C2
Трипсин 3F 10Y 4W 3H 0C 2M 6C2

Примечание: C2 — димер цистеина (цистин); число перед аминокислотой — количество остатков в макромолекуле

Вместе с тем (табл.

5), наблюдаемые отличия качественно не мешают сопоставлению перекрывающихся полос поглощения, принадлежащих разным по типу боковой группы, аминокислотам (см. 3.3).

Мы проследили связь между отношением количества аминокислотных остатков тирозина к триптофану (табл. 4) и отношением интенсивностей пиков второй производной спектров поглощения с номерами полос 19 и 20 как для аддитивных моделей (табл. 5), так и для нативных белков (табл. 2 и 3). Результаты анализа сведены в табл. 6. Так как в диапазоне длин волн от 270 нм и выше поглощение апобелковой компонентой практически полностью определяется тирозиновыми и триптофановыми остатками, а полосы №19 и №20 наиболее выражены, то это обстоятельство позволило наиболее точно оценить характер данной зависимости.

Отношение количества аминокислотных остатков тирозина к триптофану к соответствующему отношению амплитуд пиков второй производной может быть аппроксимировано экспоненциальной зависимостью с коэффициентом детерминации (г2), равным 99,999 % (рис. 22). Это позволяет выполнять прогнозы исходя из известного соотношения аминокислотных остатков в макромолекуле или соотношения амплитуд пиков второй производной в ее спектре поглощения. Однако высокое значение Г для этой зависимости не означает, что данная функция имеет физический смысл.

Таблица 5. Плохо разрешенные полосы в аддитивных спектрах поглощения (модельных по апобелку), выявленные с помощью второй производной
Полоса, № Длина волны, нм
HbA HbF Каталаза Альбумин Трипсин R
1
2 241,6 241,6 241,6 241,6 241,6л 0,0
3 242,4* 242,6* 242,8* 0,4
4 244,2* 244,2* 244,2* 244,2* 244,2* 0,0
5 246,8 246,8 246,8 246,8 245,8*-?

247,4*-?

1,0-?

0,6-?

6
7 248,8* 248,8* 248,8* 248,8* 249,0* 0,2
8 251,4 251,4 251,4 251,4 251,4 0,0
9 254,8* 255,0* 254,8* 254,8* 255,0* 0,2
10 257,2 257,2 257,2 257,2 257,2 0,0
11 260,6 260,4 260,6 260,6 260,2л 0,2
12 263,2 263,2 263,2 263,2 263,2 0,0
13 267,0 267,0 267,0 267,0 267,0 0,0
14 268,6* 268,6* 268,6* 268,6* 268,6* 0,0
15 269,8* 269,8* 269,8* 269,8* 0,0
16 271,6 271,6 272,4 271,4 271,8 1,0
17 274,2* 274,2* 274,4* 274,2* 274,4* 0,2
18 276,4 276,6 275,8 275,4 276,0 1,2
19 282,0 282,0 282,0 282,2 282,0 0,2
20 288,8 288,8 289,0 289,2 288,8 0,4

Примечание: № полосы аддитивных моделей спектров поглощения ассоциирован с № полосы в спектрах поглощения нативных белков; « *» — возможные полосы, «?» — неточная оценка, «Л» — предполагаемые полосы на основе прогноза, «—» — полосы не определялись, R — размах выборки

Таблица 6.
Соотношение количества аминокислотных остатков тирозина к триптофану и соотношение амплитуд некоторых пиков вторых производных в спектрах поглощения белков
Белок mY/nW d2А19/20
Аддитивная

модель

Нативный

белок

Оксигемоглобин F 1,25 0,62 0,51
Карбоксигемоглобин A 2,00 0,83 0,55
Г емоглобин (CAS 9008-02-0) 0,57
Гемоглобин A 0,58
Дезоксигемоглобин A 0,62
Метгемоглобин A 0,63
Оксигемоглобин A 0,64
Трипсин (CAS 9002-07-7) 2,50 0,97 0,97
Каталаза (CAS 9001-05-2) 3,50 1,36 0,92
Альбумин (CAS 9048-46-8) 10,00 20,33 13,84

Примечание: mY/nW — отношение количества аминокислотных остатков

2

тирозина к триптофану; d A19/20 — отношение амплитуд пиков вторых производных спектров поглощения с номерами полос 19 и 20

Зависимость соотношений амплитуд пиков второй производной между аддитивным спектром и спектром поглощения нативной макромолекулы может быть представлена линейной моделью с r2 = 99,963 % (рис. 23).

Таким образом, становится возможным связать соотношения амплитуд пиков вторых производных в спектрах поглощения нативных белков с соотношением боковых групп аминокислот в их макромолекулах. Известное значение содержания того или иного аминокислотного остатка позволяет через такое соотношение найти недостающее значение по другому остатку.

Вероятно, таким способом можно будет находить недостающие значения

Рис. 22. Зависимость отношения амплитуд пиков вторых производных в аддитивных спектрах поглощения от отношения количества аминокислотных остатков тирозина к триптофану

Обозначения: оксигемоглобин F (1), оксигемоглобин A (2), трипсин (3), каталаза (4), альбумин (5); по оси абсцисс — отношение количества аминокислотных остатков тирозина к количеству аминокислотных остатков триптофана mY/nW; по оси ординат — десятичный логарифм отношения пика полосы №19 к .№20 (lg(d A19/20))

Примечание: номера полос указывают на области поглощения гомологичных пиков (положение пиков по оси ординат вариабельно и зависит от типа белка и микроокружения его аминокислотных остатков, точные значения приведены в табл. 2, 3 и 5)

Рис. 23. Зависимость соотношения амплитуд пиков вторых производных в спектрах поглощения (диаграмма рассеяния)

Обозначения: оксигемоглобин F (1), оксигемоглобин A (2), трипсин (3), каталаза (4), альбумин (5); по оси абсцисс — десятичный логарифм отношения пика полосы №19 к №20 (lg(d A19/20)) в аддитивном спектре; по оси ординат тоже — в спектре поглощения нативного белка

Примечание: номера полос указывают на области поглощения гомологичных пиков (положение пиков по оси ординат вариабельно и зависит от типа белка и микроокружения его аминокислотных остатков, точные значения приведены в табл. 2, 3 и 5)

для аминокислотных остатков и в других парах отношений: F/Y, F/W.

Следующим шагом исследований стала идентификация перекрывающихся полос поглощения хромофоров нативного белка путем их переноса в систему «аддитивная модель спектра апобелка^-спектры свободных аминокислот, взятые в парциальных отношениях». Возникающая при этом неизбежная формализация, не меняет качественного представления о роли того или иного аминокислотного остатка в формировании соответствующих полос в спектре поглощения нативной молекулы белка (рис. 19-21).

Так, несмотря на то, что суперпозиция пика поглощения в нативной молекуле белка и его модели может сильно отличаться друг относительно друга по положению на оси абсцисс (рис. 20), однако относительная разность хода между формирующими эти суперпозиции пиками аминокислотных остатков может быть существенно меньше из-за однонаправленного волнового сдвига последних.

<< | >>
Источник: Лавриненко Игорь Андреевич. РАЗРЕШЕНИЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ПЕРЕКРЫВАЮЩИХСЯ ПОЛОС ПОГЛОЩЕНИЯ ХРОМОФОРОВ НЕКОТОРЫХ ПРОСТЫХ И СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ В ДИАПАЗОНЕ ДЛИН ВОЛН 240-320 НМ. 2015

Еще по теме 3.2 Соотнесение полос поглощения в спектрах белков к полосам поглощения в спектрах аддитивных моделей:

  1. ВВЕДЕНИЕ
  2. 1.1 Структура, некоторые физико-химические и спектральные свойства простых белков и апобелковой составляющей сложных белков
  3. 3.2 Соотнесение полос поглощения в спектрах белков к полосам поглощения в спектрах аддитивных моделей
  4. 3.3 Идентификация полос поглощения в спектрах белков путем их сопоставления в системе «аддитивная модель апобелка-свободные аминокислоты»
  5. 4.2 Разложение УФ-спектров светопоглощения производных гемоглобина на составляющие поглощения апобелка и простетических групп
  6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ