<<
>>

5.1 Сравнительный анализ УФ-спектров поглощения апобелковой составляющей окси-, карбокси-, дезокси- и метгемоглобина

Изменение спектральных свойств гемоглобина при реконфигурации электронной структуры комплексообразователя в ходе его окисления/восстановления или замене гемового лиганда продемонстрировано рядом работ [14, 19].

Однако проекции этих модификаций в спектрах гембелка чаще всего приводят для видимого диапазона длин волн, где не поглощает апобелковая компонента [10].

Наблюдаемые изменения в УФ-спектрах при этом не дифференцируют на составляющие поглощения белковой и небелковой частей биополимера в силу ряда ограничений [4]. Одной из причин является невозможность физического разделения апобелковой и гемовой компонент без нарушения их структурного состояния и влекущее, критическое для адекватного анализа, изменение спектральных свойств этих составляющих относительно таковых для нативной макромолекулы.

В предыдущей главе нами была показана специфика и роль гемовой компоненты в поглощении гембелком УФ-света. Как было показано, общая доля в светопоглощении небелковой составляющей для УФ-диапазона и степень ее изменения достаточно велики относительно апобелковой части макромолекулы.

При этом полученные модели УФ-спектров поглощения простетических групп отлично коррелируют с их гомологичными участками спектра в видимом диапазоне, что подтверждает адекватность используемых подходов и получаемых моделей (рис. 44).

Вместе с тем, изменения в гемовой части макромолекулы, обусловленные присоединением лигандов или окислением атома железа, приводят к выраженным в той или иной степени структурным перестройкам апогемоглобина [55]. По причинам, указанным выше, сопоставление интегральных спектров поглощения гемоглобина различных лигандных форм, даже с применением нормирования для этих спектров, не позволяет корректно оценить такого рода эффекты.

Решению данной задачи удовлетворяют два взаимодополняющих приема: дифференцирование спектра поглощения позволяет найти изменения в его тонкой структуре, а анализ модельного спектра апобелка (A), полученного путем разложения интегрального спектра (С), дает возможность оценить общую картину поглощения и характерные изменения компоненты A.

Особенность поглощения гемовой составляющей позволяет анализировать спектр апобелка с помощью второй производной, не разделяя интегральный спектр нативной макромолекулы на составные части (см. 3.1).

На рис. 50 показаны полученные на предыдущем этапе (см. 4.2) модели спектров поглощения апогемоглобина A для окси- (кривая 1), карбокси- (кривая 2), дезокси- (кривая 3) и метформы белка (кривая 4).

Из представленных данных следует, что модель спектра поглощения апобелковой составляющей для дезоксигемоглобина отличается от аналогичных моделей для окси-, карбокси- и метгемоглобина. Это различие нами было показано как при сопоставлении дифференцированных (dA) спектров поглощения производных гемоглобина, так и путем сравнения величин r для вторых производных спектров поглощения моделей апобелка и спектров поглощения нативных макромолекул (или сравнением этих коэффициентов для вторых производных исходных спектров светопоглощения).

По всей видимости, наблюдаемые отличия в спектрах поглощения моделей апобелка связаны с присутствием гемовых лигандов (O2, CO, H2O или OH-) в шестом координационном положении атома железа для HbO2, HbCO и MtHb относительно Hb. Эта закономерность будет рассмотрена ниже.

Фиксируемые изменения в спектрах производных гемоглобина отмечаются, прежде всего, в диапазоне 272,5-320,0 нм (рис. 50, 51), т.е. там, где

в,

Рис. 50. Модели спектров поглощения апогемоглобина A в диапазоне длин волн 270,0-297,5 нм

Обозначения: оксигемоглобин (1), карбоксигемоглобин (2),

дезоксигемоглобин (3) и метгемоглобин (4); е — молярный показатель поглощения

Примечание: протокол эксперимента — вариант «B»

As,

Рис.

51. Разностные спектры поглощения моделей спектров апобелка для окси-, карбокси- и метгемоглобина A относительно их дезоксиформы в диапазоне длин волн 270,0-297,5 нм

Обозначения: оксигемоглобин (1), карбоксигемоглобин (2) и

метгемоглобин (3); вертикальные линии проведены по экстремумам для оксигемоглобина (максимальная разность поглощения в моделях апобелка для окси- и дезоксигемоглобина); As — разность в молярных показателях поглощения относительно дезоксигемоглобина

Примечание: протокол эксперимента — вариант «B»

практически полностью поглощают аминокислотные остатки тирозина и триптофана (полосы №№15-20, табл. 2).

Показано (рис. 50, 51), что при длинах волн от 295 нм и более не обнаруживаются существенные различия в спектрах поглощения окси-, карбокси- и метгемоглобина относительно дезоксиформы этого белка. Так как в данном диапазоне (295-320 нм) поглощение света практически полностью определяется боковыми группами триптофана и для них не наблюдается волновой сдвиг при переходе из дезоксиформы белка в другие дериваты, то из этого следует, что хромофоры радикалов этой аминокислоты значимо не меняют спектры поглощения производных апогемоглобина в ходе конформационных перестроек макромолекулы.

Отсутствие существенных изменений в спектре поглощения хромофоров триптофана при связывании лигандов O2 и CO, а также при изменении степени окисления гемового железа хорошо иллюстрируют вторые производные спектров поглощения дериватов гемоглобина (переход №20, рис. 52).

Поэтому, на наш взгляд, не стоит ожидать больших и главным образом нескоррелированных (прямо или опосредованно) изменений в спектрах поглощения хромофоров этой аминокислоты в более широком диапазоне длин волн, т.е. 240-320 нм. Сказанное относится и к другим хромофорам, их системам, которые выступают как единый ансамбль. Естественно, при этом не следует принимать во внимание изосбестические точки в спектре поглощения (если они возникают) при переходе хромофора из одного электронного состояния в другое, т.к.

такие точки отражают эквивалентность этих состояний по интенсивности поглощения для закрытой мультикомпонентной системы. Вместе с тем, изосбестические точки очень важны с точки зрения спектрального анализа этих систем, в частности, определения концентрации компонент, входящих в нее [9].

Кроме этого, из полученных данных не следует, что «красный» волновой сдвиг для триптофана в макромолекуле гембелка относительно свободной аминокислоты также будет меньше, чем для тирозина. Другими словами, формирование пептидной связи с участием молекул триптофана или изменение

Рис. 52. Вторые производные аддитивной модели спектра поглощения апогемоглобина, спектров поглощения нативных

гемпроизводных белка

Обозначения: модель апогемоглобина (1), карбоксигемоглобин (2), оксигемоглобин (3), дезоксигемоглобин (4) и метгемоглобин (5); по оси ординат — поглощение (A); контурные стрелки показывают направление изменений в полосе №19

Примечание: спектры поглощения смещены друг относительно друга по оси ординат на константу; протокол эксперимента — вариант «B»

показателя преломления среды микроокружения его радикала, возможно, приводит к большему волновому сдвигу в поглощении хромофоров боковой группы аминокислоты данного типа, чем для тирозина. Но в дальнейшем, влияние такого микроокружения для хромофоров радикалов аминокислот, как в случае тирозина, видимо, имеет большее значение с точки зрения поглощения УФ-света. Возможно, следует рассматривать волновой сдвиг для свободных аминокислот формально как сумму составляющих: сдвиг, обусловленный образованием пептидной связи и сдвиг, связанный с изменением микроокружения хромофоров боковых групп, в т.ч., показателя преломления среды.

Таким образом, последовательным исключением компонент (различных по типу боковых групп аминокислот), становится возможным определить, какой тип аминокислотного остатка в этом случае вносит существенный вклад в изменение спектров поглощения апобелка при связывании гемового лиганда или изменении степени окисления комплексообразователя.

Этой аминокислотой является тирозин.

Мы проанализировали изменение спектральных свойств тирозина в ходе конформационных перестроек макромолекулы белка альтернативным (к методу последовательного исключения) способом.

Как уже отмечалось (см. 3.3), полоса №19 в спектрах белков и их моделей представляет собой суперпозицию пиков поглощения тирозина (282,4 нм) и триптофана (281,6 нм). Тогда, в случае смещения спектра поглощения тирозина в сторону больших длин волн при отрыве гемового лиганда, будет происходить соответствующее смещение пика №19, что и представлено на рис. 52.

Следовательно, достаточно проанализировать параметры полос поглощения №19 и №20, чтобы оценить не только соотношение аминокислотных остатков тирозина и триптофана в макромолекуле (см. 3.2, рис. 22 и 23, а также см. 3.3), но и выявить волновой сдвиг в спектре поглощения тирозина в составе апобелка при изменении микроокружения боковых групп этой аминокислоты.

Представляет интерес, насколько заметно будет изменяться спектр поглощения тирозина в полосах №№15-18 (для нативного гембелка — область

Рис. 53. Вторые производные спектров поглощения карбокси-, окси-, дезокси- и метгемоглобина, аддитивной модели

апогемоглобина

Обозначения: карбоксигемоглобин (1), оксигемоглобин (2),

дезоксигемоглобин (3), метгемоглобин (4), модель апогемоглобина (5); вертикальные пунктирные линии проведены по минимумам в спектрах поглощения для оксигемоглобина (оцениваемых по второй производной); по оси ординат — поглощение (A); контурные стрелки показывают направление изменений в полосах поглощеия №№15-18

Примечание: спектры поглощения смещены друг относительно друга по оси ординат на константу; протокол эксперимента — вариант «B»

272,5-282,5 нм), т.к. на этом участке спектра он сильно перекрывается и интерферирует со спектром поглощения триптофана (рис.

53) [23].

Однако даже на этом фрагменте спектра удается достаточно отчетливо наблюдать изменения, обусловленные «красным» волновым сдвигом в поглощении тирозина при переходе гембелка в дезоксиформу. Ранее, на примере молекулы гемоглобина [41] и альбумина (см. 3.3), нами детально проанализирован вклад полос поглощения тирозина и триптофана

(регистрируемых по второй производной) в формирование аддитивного спектра светопоглощения этих белков.

Хорошее соответствие спектров поглощения аддитивной модели гемоглобина к нативному белку (см. 3.2), позволяет, по нашему мнению, успешно переносить результаты анализа вклада отдельных аминокислот в модельный (аддитивный) спектр поглощения не только для гембелка и его производных, но и использовать результаты такого анализа, полученные для других белков, в частности, альбумина.

Другими словами, исследование роли боковых групп аминокислот в формировании аддитивной модели спектра поглощения одного простого белка (альбумина) позволяет в конечном итоге экстраполировать результаты к спектрам поглощения нативной молекулы другого сложного белка (гемоглобина), что обобщает этот подход.

Итак, изменение микроокружения аминокислотных остатков тирозина в макромолекуле приводит к регистрируемым вариациям в спектрах поглощения лигандных форм гемоглобина, что хорошо согласуется с данными, представленными на рис. 19, где показана лабильность полос поглощения, пики которых формируются с участием этой аминокислоты.

Из рис. 19 и 24 также следует, что положение пиков поглощения аминокислотных остатков фенилаланина для различных белков меняется незначительно (в пределах случайной ошибки).

Мы сравнили положение пиков поглощения боковых групп фенилаланина для различных производных гемоглобина (рис. 54). Из представленных данных

Рис. 54. Вторые производные аддитивной модели спектра поглощения апогемоглобина, спектров поглощения нативных

гемпроизводных белка

Обозначения: модель апогемоглобина (1), карбоксигемоглобин (2), оксигемоглобин (3), дезоксигемоглобин (4) и метгемоглобин (5); по оси ординат — поглощение (A)

Примечание: спектры поглощения смещены друг относительно друга по оси ординат на константу; стрелками отмечены только некоторые полосы поглощения; протокол эксперимента — вариант «B»

следует, что положение полос поглощения фенилаланина практически не меняется, а небольшое варьирование их местоположения обусловлено, вероятно, случайными ошибками.

Закономерностей в изменении интенсивности и положении полос поглощения для дезоксигемоглобина по отношению к остальным производным гембелка нами также не зафиксировано. Следовательно, боковые группы фенилаланина, аналогично группам триптофана, не вносят сколько-нибудь значимого вклада в трансформацию спектра поглощения гемоглобина при переходе из дезокси- в другие лигандные формы этого белка.

При этом, как отмечалось ранее (см. 3.3), на положение пиков поглощения аминокислотных остатков фенилаланина радикалы других аминокислот практически не влияют.

Изменение спектров поглощения боковых групп серосодержащих аминокислот и гистидина в составе гембелка с помощью дифференциальной спектрофотометрии второго порядка, а также путем разложения интегрального спектра макромолекулы обнаружить не удалось. Это обусловлено их низкой парциальной долей светопоглощения и отсутствием при этом выраженных пиков в спектрах поглощения для данных аминокислот.

Таким образом, регистрация изменений в спектрах поглощения гемоглобина, связанных с соответствующим изменением спектров светопоглощения аминокислотных остатков требует выполнения следующих условий: 1) высокая доля поглощения того или иного типа хромофора аминокислоты или наличие выраженного пика светопоглощения (этому условию в заданном диапазоне длин волн удовлетворяют только фенилаланин, тирозин и триптофан); 2) «чувствительность» боковой группы аминокислоты к изменению микроокружения ее хромофора (в основном тирозин) и 3) фактическое изменение микрооружения при перестройке макромолекулы из одного конформационного состояния в другое (главным образом тирозин).

Так как близость места протонирования гидроксильной группы тирозина к п-электронной системе бензойного кольца приводит в полярном растворителе к значительному волновому сдвигу относительно фенилаланина, а снижение локальной симметрии бокового радикала (до C2v) за счет наличия -OH группы увеличивает интенсивность поглощения этой аминокислоты, то данное обстоятельство делает тирозин удобным «индикатором» конформационных превращений макромолекулы белка (во всяком случае, для гемоглобина) [23].

Вместе с тем, для триптофана варьирование концентрации протонов в среде мало влияет на поглощение его боковых групп [23]. Причем значения pKa для этой аминокислоты выходят за пределы диапазона pH, где сохраняется функциональная активность белка [28].

Однако следует отметить, что высокий квантовый выход флуоресценции для триптофана (достигающий значения -0,2) позволяет использовать данную аминокислоту при исследовании структурно-функциональных свойств белков люминесцентными методами в тех случаях, когда не происходит тушения возбужденных состояний исследуемым биополимером (например, за счет простетических групп [34]).

Из схемы оксигенации М. Перутца [138], следует, что аминокислотные остатки Y140a и Y145p, а также Y42 а играют важную роль в ходе связывания кислорода гемоглобином. Исходно в дезоксигемоглобине остатки Y140a и Y145p жестко закреплены в полостях F и H ван-дер-ваальсовыми и водородными связями, однако, в процессе оксигенации эти боковые группы становятся лабильными, причем остатки Y42a формируют водородную связь с D99p [18].

Следовательно, представляется возможным связать изменение структурно­функционального состояния молекулы апогемоглобина в процессе оксигенации [138] со спектральными свойствами изолированных аминокислот, созданными на их основе моделями апобелка и, в дальнейшем, соотнести полученные результаты к структурному состоянию апопротеиновой компоненты карбокси- и метгемоглобина.

Так как гемовое железо жестко связано с проксимальным лигандом H8, а порфириновое кольцо, контактируя с глобиновой частью, выступает в качестве «опоры» для этого «рычага», приводящего макромолекулу, ее субъединицы в новое конформационное состояние [38], то становится возможным связать изменения в спектрах поглощения моделей апобелка различных дериватов гемоглобина с положением комплексообразователя относительно плоскости протопорфирина IX.

Из полученных модельных спектров поглощения апобелковой составляющей и их анализа следует ожидать, что только для дезоксиформы белка положение атома железа в геме должно сильно отличаться от других производных. При этом сходство между собой моделей спектров светопоглощения остальных форм белка также должно быть проекцией местоположения железа в плоскости порфиринового кольца.

Так как данные литературы по значению положения гемового железа относительно плоскости порфиринового кольца для одной и той же формы белка сильно разнятся [38, 60], то мы провели собственные вычисления, базируясь на данных рентгеноструктурного анализа.

Определение положения атома железа к порфириновому кольцу выполнено с помощью приведенной формулы:

ha = 2(Р - a)(P - Ь)(P - C)ia , (31)

p = (a + b + c)/2, (32)

где ha — высота разностороннего треугольника с атомом железа в вершине к основанию а, как отрезку между диагональными атомами азота (N-N), b и c — отрезок между атомами азота и железа (Fe-N) (рис. 55).

Результаты измерения межатомных расстояний между атомами азота и железа для окси- (PDB 2DN1), карбокси- (PDB 3HXN), дезокси- (PDB 2DN2) и метгемоглобина (PDB 3ODQ) [144] представлены в табл. 11.

Средние значения расстояний между атомом железа и плоскостью порфиринового кольца для каждой из форм гемоглобина при этом составили: 0,0 пм (0,000 A; HbO2), 4,9 пм (0,049 A; HbCO), 34,4 пм (0,344 A; Hb) и 3,6 пм (0,036 A; MtHb).

Рис. 55. Положение атома железа в плоскости порфиринового кольца молекулы дезоксигемоглобина

Обозначения: в вершине 4-х сторонней пирамиды атом железа (Fe) с 4-мя координационными связями с атомами азота (N) в ее основании; расстояния между атомами железа и азота показаны пунктирными линиями с метками расстояний; дистанция выражена в пикометрах

Примечание: расстояние между атомом железа и плоскостью порфиринового кольца рассчитано как среднее арифметическое высот к основанию 2-х треугольников, перпендикулярных своими плоскостями (X) и (Y) друг к другу для всех субъединиц белка

Ввиду того, что дезоксигемоглобин (исходя из представлений модели Моно-Уаймена-Шанжё [127]), находится, в основном, в T-состоянии, а оксиформа — в R-конфигурации, можно предположить, что карбокси- и метгемоглобин также могут находиться в R-состоянии как по причине подобия моделей их спектров поглощения с таковым спектром для HbO2, так и по сходному положению железа в плоскости порфиринового кольца.

Таблица 11. Расстояние между атомом железа и плоскостью порфиринового кольца в молекулах окси-, карбокси-, дезокси- и метгемоглобина
Расстояние между атомами в субъединицах (пм)
Образец Отрезок a1 в 1 а2 в 2
Плоскость Плоскость Плоскость Плоскость
X Y X Y X Y X Y
a (N-N) 403,0 402,0 410,0 398,0
HbO2 b (Fe-N) 202,0 202,0 211,0 200,0
c (Fe-N) 201,0 200,0 199,0 198,0
ah (Fe±NN) 0,0 0,0 0,0 0,0
a (N-N) 387,0 383,0 397,0 381,0 386,0 384,0 383,0 380,0
ньсо b (Fe-N) 195,0 194,0 200,0 193,0 193,0 193,0 194,0 190,0
c (Fe-N) 194,0 190,0 197,0 190,0 193,0 191,0 189,0 190,0
ah (Fe±NN) 19,7 13,8 0,0 19,5 0,0 0,0 0,0 0,0
a (N-N) 415,0 412,0 415,0 412,0 413,0 406,0 407,0 407,0
Hb b (Fe-N) 212,0 212,0 212,0 210,0 210,0 210,0 208,0 207,0
c (Fe-N) 211,0 208,0 208,0 209,0 208,0 202,0 204,0 206,0
ah (Fe±NN) 40,9 40,8 32,3 38,1 32,2 35,0 32,0 35,1
a (N-N) 412,0 405,0 405,0 399,0 412,0 405,0 405,0 399,0
b (Fe-N) 209,0 203,0 203,0 203,0 209,0 203,0 203,0 203,0
MtHb
c (Fe-N) 203,0 202,0 202,0 196,0 203,0 202,0 203,0 196,0
ah (Fe±NN) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 14,2 0,0

Примечание: молекула оксигемоглобина представлена димером; расстояния выражены в пикометрах (пм)

Таким образом, полученные результаты вычислений положения атома железа находятся в очень хорошем соответствии с результатами моделирования спектров поглощения производных гемоглобина (их апобелковой компоненты).

Причем реконфигурация структурного состояния макромолекулы гемоглобина при связывании лигандов O2 и CO (а также изменении степени окисления комплексообразователя), также приводит к соответствующему наблюдаемому изменению спектральных свойств апобелка, хотя и менее значимому, чем для гемовой составляющей.

Предложенную нами модель спектра поглощения дезоксигемоглобина F (рис. 48), полученную на основе апобелковой компоненты оксигемоглобина F и небелковой части гемоглобина A, следует считать менее точной, чем аналогичные модели окси-, карбокси- и метгемоглобина F. Однако такая аппроксимация, созданная в первом приближении, достаточно хорошо характеризует общее светопоглощение моделируемой дезоксиформы белка.

<< | >>
Источник: Лавриненко Игорь Андреевич. РАЗРЕШЕНИЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ПЕРЕКРЫВАЮЩИХСЯ ПОЛОС ПОГЛОЩЕНИЯ ХРОМОФОРОВ НЕКОТОРЫХ ПРОСТЫХ И СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ В ДИАПАЗОНЕ ДЛИН ВОЛН 240-320 НМ. 2015

Еще по теме 5.1 Сравнительный анализ УФ-спектров поглощения апобелковой составляющей окси-, карбокси-, дезокси- и метгемоглобина:

  1. ВВЕДЕНИЕ
  2. 4.2 Разложение УФ-спектров светопоглощения производных гемоглобина на составляющие поглощения апобелка и простетических групп
  3. 5.1 Сравнительный анализ УФ-спектров поглощения апобелковой составляющей окси-, карбокси-, дезокси- и метгемоглобина
  4. 5.2 Исследование УФ-спектров поглощения простетических групп окси-, карбокси-, дезокси- и метгемоглобина