<<
>>

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Среди методов исследования структурно­функциональных свойств белков спектроскопия электронных переходов (электронная спектроскопия) занимает особое место. Данный метод может выступать, и как конечный этап измерений, например, как фотометрическое окончание при определении концентрации белка, и как основа для последующего анализа структуры белка более сложными, дорогостоящими методами, например, как спектроскопия ядерного магнитного резонанса.

С помощью этого метода в условиях, близких к естественным средам живого организма, может быть изучено множество структурных состояний макромолекулы и ее конформационных перестроек при действии целого ряда физико-химических факторов (в т.ч., и в реальном масштабе времени [119]). При этом, регистрируемое изменение спектральных свойств этой макромолекулы несет в себе важную информацию не только о ее состоянии, но и характере микроокружения ее хромофоров и молекулы белка в целом.

Доступность спектрофотометрического метода широкому кругу исследователей является важным преимуществом, что позволило аккумулировать достаточно большой объем информации по данному направлению. Тем не менее, в этой области знаний существуют определенные проблемы, которые, на наш взгляд, разрешены не в полной мере.

Часть таких исследований ориентирована на соотнесение полос поглощения к переходам, которые их формируют. Для ряда модельных систем, начиная от отдельных хромофорных групп в составе простых химических соединений, до хромофоров боковых групп аминокислот в составе полипептидных цепей, а также изолированных простетических групп белка и их производных, изменяя параметры среды, удалость выявить особенности происхождения тех или иных полос поглощения, и в ряде случаев, сопоставить к соответствующим электронным термам молекулы.

Однако различия в условиях проведения эксперимента и способов оценки полос поглощения при изучении нативных белков не позволяют корректно оценить диапазон варьирования их максимумов по местоположению и интенсивности.

Это затрудняет сравнительную оценку полос светопоглощения для белков, сходных по своему аминокислотному составу и структуре, но полученных по различному протоколу эксперимента.

Таким образом, небольшие девиации в спектре светопоглощения белка при воздействии на него различных физико-химических агентов могут быть маскированы различием протоколов эксперимента, представленных в опубликованных работах. При этом, в спектрах поглощения макромолекул хромофоры аминокислотных остатков, и в принципе простетических групп, могут формировать суперпозицию полос поглощения, пики которой из-за интерферирующего эффекта могут менять свое положение. Причем, эти изменения могут быть обусловлены только различием в соотношении количества однотипных радикалов боковых групп аминокислот тех или иных белков при одинаковых или сходных условиях микроокружения макромолекул.

Принимая это во внимание, для корректной оценки данных изменений необходимо, с одной стороны, выработать приемлемые способы или «стандарты» в оценке этих полос поглощения, доступных для большинства исследователей, с другой — изучить степень варьирования положения пиков поглощения для нативных белков в среде, близкой к естественной среде функционирующего белка, а также их определенным способом классифицировать.

Другая проблема, связанная с предыдущей, состоит в том, что разделение физико-химическими методами белка на составляющие зачастую приводит к ненадлежащим результатам исследований, вследствие нарушения системы внутримолекулярных взаимодействий. При этом изменения в локальном окружении хромофоров могут повлечь за собой соответствующие изменения их спектральных свойств.

Возможным путем решения обсуждаемой проблемы является разложение интегрального спектра поглощения вещества математическими методами,

которые лишены рассмотренных недостатков, но имеющих, безусловно, из-за формализации свои ограничения.

Решение данной задачи потребует разработки способа разложения интегрального спектра на составляющие, который мог бы быть универсальным, и в принципе, применимым по своему подходу к решению аналогичных задач, выходящих за рамки спектрального анализа белков.

Это может быть достигнуто созданием алгоритма и его математической реализации, опираясь, в том числе, и на существующие методы обработки сложных сигналов, известных своим применением в различных областях физики [157].

В связи с вышеизложенным, в настоящей работе нами проанализированы спектральные свойства простых белков — трипсина и альбумина, сложных белков — каталазы, гемоглобина и его производных по апобелковой и гемовой части макромолекулы: оксигемоглобина A и F, карбокси-, дезокси- и

метгемоглобина A.

Цель исследования. Целью настоящей работы явилось разрешение, идентификация и анализ перекрывающихся полос поглощения хромофоров некоторых простых и сложных белков в диапазоне длин волн 240-320 нм.

Задачи работы предусматривали:

1. Подбор оптимальных режимов работы спектрофотометра при регистрации данных и рациональных способов комбинированной цифровой фильтрации интегральных, разностных и дифференцированных спектров поглощения белков;

2. Разрешение полос поглощения в спектрах белков с помощью второй производной;

3. Соотнесение полос поглощения в спектрах белков к полосам поглощения в спектрах аддитивных моделей;

4. Идентификацию полос поглощения в спектрах белков путем их сопоставления в системе «аддитивная модель апобелка-свободные аминокислоты»;

5. Разработку способа разложения УФ-спектров поглощения хромопротеидов на составляющие светопоглощения апобелковой и небелковой компонент;

6. Разложение УФ-спектров светопоглощения производных гемоглобина на составляющие поглощения апобелка и простетических групп;

7. Сравнительный анализ УФ-спектров поглощения апобелковой составляющей окси-, карбокси-, дезокси- и метгемоглобина;

8. Исследование УФ-спектров поглощения простетических групп окси-, карбокси-, дезокси- и метгемоглобина.

Научная новизна. Работа представляет собой систематическое исследование спектров поглощения некоторых простых и сложных белков в диапазоне длин волн 240-320 нм с привлечением математических методов обработки сложных сигналов.

Показано, что вторые производные спектров светопоглощения некоторых простых и сложных белков (трипсина, альбумина, каталазы, гемоглобина и его производных: оксигемоглобина A и F, карбокси-, дезокси- и метгемоглобина A) содержат до 20 пиков различной степени разрешения и интенсивности, ассоциируемых с полосами поглощения, и которые, в свою очередь, были классифицированы по принадлежности к тем или иным типам аминокислотных остатков и суперпозиции светопоглощения последних.

Установлено, что моделирование спектров поглощения гемоглобина путем рекомбинации белковой и небелковой составляющих оксиформ A и F показало их высокую аддитивность по отношению к результирующему спектру макромолекулы гембелка.

Выявлено, что изменения в моделях спектров поглощения апобелка производных гемоглобина коррелируют с изменениями положения атома железа относительно порфиринового кольца простетических групп.

Спектрофотометрическим методом показано, что лигандирование гемового железа приводит к изменению спектров поглощения тирозиновых аминокислотных остатков в молекуле гембелка.

В модельных спектрах светопоглощения гемовой компоненты белка обнаружены полосы поглощения, перекрывающиеся и маскирующиеся полосами поглощения апобелковой части макромолекулы.

Рассчитана относительная интегральная доля поглощения небелковой компоненты гемоглобина и его производных в диапазоне длин волн 240-320 нм.

На примере гемоглобина предложен и обоснован способ разложения спектров светопоглощения хромопротеидов на составляющие поглощения белковой и небелковой компонент.

Предложена схема расположения пиков полос поглощения электронных переходов, отвечающих за спектральные свойства белковых макромолекул.

Практическая значимость. Полученные результаты систематизируют, расширяют и углубляют современные представления о спектральных свойствах простых и сложных белков на примере трипсина, альбумина, гемопротеидов.

Результаты работы представляют интерес как для биофизиков, биохимиков, для которых спектральный анализ является одним из основных аналитических методов изучения белков, так и для фотобиологов, исследующих влияние УФ-света на эти биополимеры.

Используемые подходы и способы анализа спектров поглощения белков, также могут быть полезны и для специалистов, сталкивающихся с практическими вопросами разрешения сложных сигналов, регистрируемых от многокомпонентных систем в случае плохого разделения их составляющих хроматографическими, электрофоретическими или другими физико-химическими методами исследования.

Результаты исследований и приемы анализа спектров поглощения белков, представленные в диссертации, нашли свое отражение в учебных программах дисциплин спецкурсов, предлагаемых студентам кафедры биофизики и биотехнологии Воронежского государственного университета.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены, доложены и обсуждены на 9-м съезде Белорусского объединения фотобиологов и биофизиков «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2010); на IV и V съездах биофизиков

России (Нижний Новгород, 2012; Ростов-на-Дону, 2015); научно-практической конференции и зонального рабочего совещания учреждений службы крови 5-й зоны РФ (Воронеж, 2012); международной научно-методической конференции «Современные проблемы биофизики сложных систем. Информационно­образовательные процессы» (Воронеж, 2013); а также на научных отчетных сессиях преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2008, 2014, 2015).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 6 статей, в том числе 3 статьи в журналах из «Перечня ВАК РФ».

На защиту выносятся следующие положения:

1. Разработан и обоснован способ разложения спектров поглощения сложных белков (оксигемоглобина A и F, карбокси-, дезокси- и метгемоглобина A) до уровня: «апобелок-простетические группы»;

2. Вторые производные спектров поглощения некоторых простых и сложных белков (трипсина, альбумина, каталазы, гемоглобина и его производных) содержат до 20 пиков полос поглощения, классифицируемых по принадлежности к тем или иным типам аминокислотных остатков и суперпозиции светопоглощения последних;

3. В недифференцированных модельных спектрах поглощения простетических групп окси- и карбоксигемоглобина регистрируется полоса, обозначенная нами как «-а»;

4. На второй производной модельных спектров поглощения производных гемоглобина выявляются две полосы, обозначенных как «-а» и «-р»;

5. Изменения в моделях спектров поглощения апобелка окси-, карбокси-, дезокси- и метгемоглобина коррелируют с изменениями положения атома железа относительно порфиринового кольца простетических групп;

6. Предложена схема расположения пиков полос поглощения электронных переходов, отвечающих за спектральные свойства белковых макромолекул.

Структура и объем работы. Диссертационная работа включает 217 страниц машинописного текста, 12 таблиц, 62 рисунка, состоит из «Введения», 5 глав, «Заключения» и «Выводов». Список литературы содержит 172 источника, из них 69 отечественных и 103 зарубежных.

<< | >>
Источник: Лавриненко Игорь Андреевич. РАЗРЕШЕНИЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ПЕРЕКРЫВАЮЩИХСЯ ПОЛОС ПОГЛОЩЕНИЯ ХРОМОФОРОВ НЕКОТОРЫХ ПРОСТЫХ И СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ В ДИАПАЗОНЕ ДЛИН ВОЛН 240-320 НМ. 2015

Еще по теме ВВЕДЕНИЕ:

  1. Введение
  2. Введение, начинающееся с цитаты
  3. 7.1. ВВЕДЕНИЕ
  4. Введение
  5. [ВВЕДЕНИЕ]
  6. ВВЕДЕНИЕ
  7. Введение Предмет и задачи теории прав человека
  8. РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЗАКОН О ВВЕДЕНИИ В ДЕЙСТВИЕ ЧАСТИ ПЕРВОЙ ГРАЖДАНСКОГО КОДЕКСА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
  9. РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЗАКОН О ВВЕДЕНИИ В ДЕЙСТВИЕ ЧАСТИ ТРЕТЬЕЙ ГРАЖДАНСКОГО КОДЕКСА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
  10. ВВЕДЕНИЕ,
  11. ВВЕДЕНИЕ
  12. ВВЕДЕНИЕ
  13. ВВЕДЕНИЕ
  14. НАЧАЛО РЕВОЛЮЦИИ. БОРЬБА ЗАВВЕДЕНИЕ КОНСТИТУЦИИ