<<
>>

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Оптимизацией режимов работы спектрофотометров и комбинированной цифровой фильтрацией получаемых исходных интегральных и дифференцированных по второму порядку спектров поглощения некоторых протеиногенных аминокислот, несущих хромофоры в составе боковых групп, а также некоторых простых и сложных белков (трипсина, альбумина, каталазы и гемоглобина), достигнуты необходимые условия, позволяющие выявлять плохо разрешенные полосы в спектрах светопоглощения изучаемых образцов в диапазоне длин волн 240-320 нм.

Отмечается некоторое несоответствие в положении пиков для исходных и производных спектров поглощения исследуемых молекул, что связано с особенностями процедуры дифференцирования. Однако наблюдаемое несоответствие не представляет сложности для анализа таких экстремумов во вторых производных спектров поглощения, т.к. сопоставление пиков осуществляется в одной и той же «системе координат».

Систематически возникающие пики-сателлиты в некоторых областях проанализированных дифференцированных спектров также могут быть дополнительными реперными точками, что позволяет по ним сравнивать спектры поглощения белков как между собой, так и с аддитивными моделями этих биополимеров, построенных на основе парциальных спектров свободных аминокислот.

Установлено, что в диапазоне длин волн 240-320 нм для рассматриваемых нами белков: трипсина, альбумина, каталазы и гемоглобина, во вторых производных их спектров поглощения обнаруживаются до 20 пиков (ассоциируемых с полосами поглощения), положение которых достаточно консервативно.

Вариабельность местоположения этих экстремумов, как известно, зависит от соотношения аминокислотных остатков в макромолекуле и характера их

микроокружения.

Причем, как нами было показано, во вторых производных спектров поглощения нативных макромолекул небелковая компонента хромопротеидов не затрудняет определение местоположения пиков апобелка по причине отсутствия у гемовых групп полос с узкой полушириной поглощения, т.е.

в некотором смысле они «оптически прозрачны».

Ввиду того, что диапазоны варьирования положения пиков апобелка по абсциссе, за некоторым исключением, не перекрываются, то целесообразно представить эти диапазоны в виде областей и присвоить им порядковые номера полос от 1 до 20, начиная от меньших длин волн.

Наличие таких устойчивых обособленных областей пиков вторых производных спектров поглощения макромолекул позволяет осуществлять прогноз положения данных максимумов, вероятно, для большинства белков, а аномалии в их расположении могут представлять дополнительный интерес при изучении структурно-функционального состояния этих биополимеров.

Так как соотнесение пиков во вторых производных спектров поглощения белков к таковым для свободных аминокислот не совсем корректно из-за возникающего в суперпозиции поглощения макромолекулы подобия интерференционной картины для ее экстремумов, то одним из способов решения данной проблемы является сопоставление с аналогичными пиками аддитивной модели апобелка, созданной на основе парциальных спектров аминокислот.

Из-за того, что вариабельность положения пиков во вторых производных аддитивных моделей апобелка, по понятным причинам (таким как, например, инвариантность микроокружения хромофоров), значимо меньше, т.е., амплитуда варьирования пиков в анализируемой системе «нативный белок—модель апобелка» лимитируется только лишь спектром нативной макромолекулы, то эффективность примененного нами подхода вполне очевидна.

Обнаруживаемый волновой сдвиг между исходным спектром нативного белка и его моделью позволяет оценивать роль микроокружения боковых групп аминокислот в составе макромолекулы, с одной стороны, с другой — скоррелированность такого сдвига дает возможность, как найти, так и уточнить местоположение некоторых плохо разрешенных пиков полос поглощения биополимера.

Последующее разложение аддитивного спектра поглощения до исходных компонент позволяет оценить вклад каждого аминокислотного остатка, входящего в определенную модель, в спектр поглощения нативной макромолекулы.

Тогда, по нашим данным, пики во второй производной спектров поглощения белков в областях с 3 по 13 обусловлены боковыми группами фенилаланина, 2 — главным образом, фенилаланина и несущественно тирозина, 1 — по всей вероятности, фенилаланина и отчасти тирозина. Ненадежно разрешенный пик в области под номером 14, вероятно, — плохо выраженная суперпозиция поглощения тирозина и фенилаланина.

Пики областей 15-20 определяются, главным образом, комбинациями экстремумов тирозина и триптофана, с возрастающим вкладом последнего в суперпозицию этих пиков с увеличением длины волны в спектре поглощения белка. Высокая чувствительность боковой группы тирозина к параметрам своего микроокружения, наряду с интерферирующим эффектом ее спектра со спектром триптофана во вторых производных, делает положение результирующих пиков в областях 15-19 наиболее лабильным, а в области 17-18 — перекрывающимися.

Отношение количества аминокислотных остатков тирозина к триптофану к соответствующему отношению амплитуд пиков второй производной как в нативных белках, так и их апобелковых моделях, может быть аппроксимировано экспоненциальной зависимостью, что позволяет выполнять прогнозы, исходя из известного соотношения их аминокислотных остатков в макромолекуле или соотношения пиков второй производной в ее спектре поглощения.

Вкладом гистидина, цистеина и метионина в формирование интегрального спектра поглощения макромолекулы можно пренебречь, т.к. они имеют, по данным модельного спектра, низкую относительную долю светопоглощения.

Кроме этого, по результатам анализа спектра аддитивной модели, данные аминокислоты, а также цистин, не вносят значимых изменений в спектр поглощения по второй производной, что объясняется отсутствием пиков в исходных (недифференцированных) спектрах этих аминокислот (цистеин, метионин), или имеющих очень большую спектральную полуширину (гистидин, цистин) в используемом диапазоне длин волн.

С целью изучения индивидуальных спектров поглощения белковой и небелковой компонент без нарушения нативной структуры макромолекулы из-за применения различных физико-химических методов разделения, нами предложен и протестирован способ разложения спектра поглощения биополимера математическими методами.

В основе этого способа используется алгоритм с определенными условиями и допущениями. Вклад белковой (А) и небелковой (B) частей в интегральный спектр (C) макромолекулы представляется аддитивной моделью. В качестве исходной модели (A0) выступает модель спектра поглощения апобелка, полученная на основе парциальных спектров аминокислот, входящих в его состав. Повышение степени соответствия А0 к целевому A достигается смещением А0 на Лх по заданному критерию, при этом получается спектр А1. Вычитанием А1 из C находится спектр поглощения простетических групп (Bi). Так как Bi содержит артефакты, обусловленные остаточным присутствием «отпечатков» полос поглощения хромофоров апобелка, аппроксимация интерполирующим полиномом по определенным критериям дает целевой спектр B. Вычитанием B из C получается A. Сравнением вторых производных A и B проверяется корректность выполненных преобразований.

Разложение исходных спектров поглощения гемоглобина A и F в окси-, дезокси-, карбокси- и метформе на белковую и небелковую составляющие показало хорошее соответствие модельных спектров светопоглощения апобелковой компоненты к спектрам простых белков, полученным экспериментальным путем по результатам собственных исследований и данных литературных источников.

Сопоставление модельных спектров поглощения (гемпроизводных) небелковой части макромолекулы (240-320 нм) со спектрами поглощения соответствующих нативных молекул гемоглобина (320-380 нм), где поглощают только простетические группы, показало, что эти части единого спектра гармонизируют между собой по наличию/отсутствию максимумов, интенсивности и степени выраженности пиков.

Практически полное (ограниченное только ошибкой измерения и неизбежными артефактами аппроксимации) совпадение модельных спектров поглощения гемовой составляющей оксигемоглобина A и F, указывает на высокую аддитивность между белковой и небелковой компонентами, что также подтверждается данными из спектров поглощения видимого диапазона (380-600 нм) для нативных макромолекул, в частности, HbAO2 и HbFO2.

Это, в свою очередь, позволяет моделировать спектры поглощения гемоглобина путем рекомбинации белковой и небелковой частей макромолекулы не только для гемоглобинов A и F, но и, по всей вероятности, и для других форм.

Анализ вторых производных интегральных спектров поглощения гемоглобина и его дериватов, а также моделей спектров светопоглощения апобелковой составляющей этих макромолекул с помощью различных методических приемов показал, что апобелковая компонента гемоглобина в дезоксиформе достаточно существенно отличается от таковых для других лигандных форм гембелка.

Вместе с тем, апобелковые части макромолекулы для окси-, карбокси и метформ гемоглобина практически идентичны с точки зрения проявления ими своих спектральных свойств.

Дальнейшее исследование выявленных различий в интегральных, разностных и дифференцированных спектрах поглощения апобелковой компоненты показало ведущую роль тирозиновых аминокислотных остатков в возникновении таких изменений. Этот факт хорошо согласуется как с данными по чувствительности боковой группы тирозина к изменению ее микроокружения, так и находится в очень хорошем соответствии со схемой оксигенации Перутца.

Вычисленная нами на основании данных рентгеновской кристаллографии дериватов гемоглобина дистанция положения гемового железа относительно плоскости порфиринового кольца для этих форм отлично коррелирует с изменениями в модельных спектрах поглощения апобелковых компонент различных гемпроизводных белка.

Анализ вторых производных аппроксимирующих полиномов как модельных спектров поглощения гемовой компоненты позволил выявить полосы в этих спектрах, обозначенные нами как «-а» и «-р». Данные полосы по соотношению интенсивностей поглощения («-а»/«-р») во вторых производных модельных спектров небелковой компоненты коррелируют с полосами а/p в видимом участке спектра для нативных гемпроизводных белка. Причем, сами полосы «-а» и «-р» по их интенсивности имеют некоторую симметрию относительно оси ординат (и полосы Соре) относительно а и р.

Нами использован ряд тестов, позволяющих в той или иной степени ассоциировать «-р»-полосу с гемовой компонентой, а не как с возможным артефактом модельного спектра вследствие различных математических преобразований и вычислений.

Однако, несмотря на приведенные аргументы в пользу наличия «-а» и «-р»-полос в спектрах поглощения производных гембелка, однозначно утверждать о присутствии, прежде всего «-р»-полосы, а отчасти «-а»-полосы для дезокси- и метгемоглобина, несколько преждевременно. Вопрос об их существовании, по нашему мнению, окончательно не снят, и для его разрешения в будущем потребуется анализ новых данных и применение новых методических приемов.

В конечном итоге, результаты наших исследований могут быть представлены в виде возможной схемы расположения областей идентифицированных пиков полос поглощения для некоторых простых и сложных белков (рис. 62).

Таким образом, комплекс мер, направленных на разрешение, идентификацию и анализ перекрывающихся полос поглощения хромофоров некоторых простых и сложных белков в диапазоне длин волн 240-320 нм

Рис. 62. Возможная схема расположения пиков полос поглощения электронных переходов, отвечающих за спектральные свойства белковых макромолекул

Обозначения: знаком «X» показана область перекрытия полос поглощения

позволил в определенной степени решить ряд задач, связанных с изучением коррелированного изменения структуры белковых макромолекул и соответствующим проявлением ими своих спектральных свойств.

Это, с одной стороны, показывает результативность спектральных методов и актуальность их применения, с другой — позволяет более эффективно исследовать влияние различных физико-химических агентов на структурно­функциональное состояние белков и их комплексов с помощью данного метода и приемов, рассмотренных и использованных в настоящей работе.

<< | >>
Источник: Лавриненко Игорь Андреевич. РАЗРЕШЕНИЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ПЕРЕКРЫВАЮЩИХСЯ ПОЛОС ПОГЛОЩЕНИЯ ХРОМОФОРОВ НЕКОТОРЫХ ПРОСТЫХ И СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ В ДИАПАЗОНЕ ДЛИН ВОЛН 240-320 НМ. 2015

Еще по теме ЗАКЛЮЧЕНИЕ:

  1. 5.14. Заключение эксперта
  2. 15.4. Окончание предварительного следствия с обвинительным заключением 15.4.1.
  3. УМОЗАКЛЮЧЕНИЕ
  4. Примечание [Обычный взгляд на умозаключение]
  5. В. УМОЗАКЛЮЧЕНИЕ РЕФЛЕКСИИ
  6. а) Умозаключение общности
  7. Ь) Индуктивное умозаключение
  8. с) Умозаключение аналогии 1.
  9. а) Категорическое умозаключение 1.
  10. Ь) Гипотетическое умозаключение