<<
>>

2.2 Выделение ДНК из периферической крови человека

Выделение ДНК проводили из венозной крови, забранной из локтевой вены в объеме 5 мл в стерильные пластиковые пробирки, содержащие 50 мкл 0.5М ЭДТА рН=8.0 как антикоагулянта. Собранная данным образом кровь подвергалась замораживанию и хранилась при температуре -20 °С.

ДНК выделяли из лейкоцитов крови стандартным фенол-хлороформным методом (Маниатис и соавт., 1984). Лизис клеточных элементов крови проводили по методу Канкеля (Lahiri et al., 1992): к 500 мл крови добавляли 500 мкл раствора для лизиса эритроцитов (29 мМ Tris-HCl pH 7.4, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCb, 5% сахароза, 1% тритон Х100), инкубировали в течение 5 мин., осторожно перемешивая, и затем центрифугировали 10 минут при +9°С, 4000 оборотов в минуту. Супернатант сливали и осадок лейкоцитов ресуспендировали в растворе для лизиса клеточных мембран (29 мМ Tris-HCl pH 7.4, 10 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 0.25 М сахароза). Смесь центрифугировали при тех же условиях, супернатант сливали. К осадку добавляли 300 мкл раствора для протеиназы К (0.01 М Tris-HCl, 0.01 М NaCl, 0.01 М ЭДТА pH 8.0), 30 мкл 30% додецилсульфата натрия и протеиназу К до ее конечной концентрации 100 мкг/мл. Смесь инкубировали в течение 2-3 часов при +50°С для протеолиза. Получившийся в результате гомогенный раствор последовательно обрабатывали 300 мкл фенола, 300 мкл смеси фенола с хлороформом в соотношении 1:1, 300 мкл хлороформа. После каждой экстракции в течение 10 мин при аккуратном перемешивании смесь центрифугировали 10 мин. при +20°С 4000 об/мин и отбирали водную фазу. По окончании экстракции к водной фазе добавляли 1/10 объема 3М ацетата натрия и 2 объема 96% этанола. Осадок ДНК центрифугировали при +9°С, 10000 оборотов в минуту, в течение 10 минут. Затем осадок дважды промывали 70% этанолом при тех же условиях центрифугирования, высушивали на воздухе, при комнатной температуре, в течение 12 часов, и растворяли в 100 мкл стерильной дистиллированной воды. Выход ДНК в результате такой очистки составлял 40-50 мкг ДНК из 500 мкл цельной крови.
<< | >>
Источник: Демина Екатерина Петровна. Экспрессия генов транскрипционных факторов LXRalpha, LXRbeta, PPARgamma и транспортера ABCA1 при атеросклерозе. 2014
Помощь с написанием учебных работ

Еще по теме 2.2 Выделение ДНК из периферической крови человека:

  1. Препараты крови человека Жидкие лекарственные формы препаратов крови
  2. Занятие 12.5 ДИАГНОСТИКА ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ РЕЧИ У ДЕТЕЙ
  3. Сдача крови
  4. Групповые факторы крови.
  5. 3.4. Выделение записей
  6. Раздел III. ОРГАНИЗАЦИЯ ДОНОРСТВА КРОВИ И ЕЕ КОМПОНЕНТОВ.
  7. 3.4. Перемещение по листу и выделение ячеек
  8. ПОРЯДОК МЕДИЦИНСКОГО ОБСЛЕДОВАНИЯ ДОНОРА КРОВИ И ЕЕ КОМПОНЕНТОВ I. Общие положения
  9. Сухие и замороженные лекарственные формыпрепаратов крови
  10. Склероз сосудов и трофические дегенерации, вызываемые нарушениями микроциркуляции крови
  11. 4.5.2. Математические модели расписаний с выделенными обслуживающими устройствами
  12. ВЫДЕЛЕНИЕ БОГАТОЙ СКОТОВЛАДЕЛЬЧЕСКОЙ ВЕРХУШКИ
  13. Два года пожаров и крови: революция на подъеме
  14. «Вступаю на престол ценою крови моих подданных»
  15. Выделение функционально-смысловых типов речи