<<
>>

Основные механизмы генной инженерии

  Технология рекомбинантной ДНК

Вот мы и добрались до генной инженерии, вызывающей у непосвященных бурю всевозможных эмоций. Если кратко, то суть генной инженерии сводится к следующему: биологи, зная, какой ген за что отвечает, выделяют его из ДНК одного организма и встраивают в ДНК другого.

В результате можно заставить клетку синтезировать новые белки, что придает организму новые свойства.

Мы знаем, что обмен генетической информацией происходит и в природе, но только между особями одного вида. Коты «ухаживают» за кошками, лисы за лисицами, кролики за крольчихами... Случаи же скрещивания особей разных видов (например, собаки и волка) хоть и случаются, но являются скорее исключениями и возможны лишь для близкородственных животных.

Перенос генов от родителей к потомкам внутри одного вида называется вертикальным. Так как возникающие при этом особи, как правило, очень похожи на родителей, в природе генетический аппарат обладает высокой точностью и обеспечивает постоянство каждого вида.

Генная инженерия дает возможность преодолевать межвидовые барьеры и передавать признаки одних организмов другим, осуществляя такие изменения генома, которые вряд ли могли бы возникнуть естественным путем. Грубо говоря, генные инженеры делают то, что всегда запрещала природа. Берут, например, ген из рыбы и вставляют его в помидор. Но не для того, чтобы помидор плавал, а чтобы его можно было хранить при низкой температуре. Перенос генов между особями разных видов называется горизонтальным (латеральным).

Молекула ДНК, собранная из кусочков ДНК различных организмов, называется рекомбинантной. Первая рекомбинантная ДНК, объединившая гены обезьяньего вируса SV40, бактериофага лямбда и галактозного оперона E.coli, была создана в 1972 году группой американских ученых под руководством П. Берга.

Однако первые “генные операции” такого рода эффективно проводились уже более 4,5 миллиардов лет назад главным “генным инженером” — Природой.

Речь идет об уже знакомых нам прокариотах — первых живых существах, населявших нашу планету еще со времен Архейской эры. Как уже говорилось, механизмы передачи генетической информации в природе обладают высокой стабильностью, призванной служить сохранению и выживанию вида. Стабильность эта, однако, не абсолютна, ведь иначе в ходе эволюции не смогло бы возникнуть такого многообразия форм жизни, свидетелями (и представителями) которых мы являемся.

Но прокариоты, как известно, размножаются простым делением, при котором каждая дочерняя клетка получает «в наследство» точную копию родительской ДНК. Откуда же возникло такое разнообразие в среде самих простейших и как могли появиться другие организмы? Одна из наиболее очевидных причин генетической изменчивости — это мутации, являющиеся, по меткому выражению Дарвина, двигателем эволюции.

Мутации — скачкообразные изменения генетического кода клетки, приводящие к появлению новых признаков. Если потомки измененной особи имеют некоторое преимущество перед обычными, например, большую жизнеспособность или повышенную скорость роста, они постепенно накапливаются и вытесняют исходных особей.

Различают мутации спонтанные (причины их возникновения неизвестны) и индуцированные. Индуцировать мутации могут различные факторы, действующие на генетический материал клетки: физические, химические или биологические.

В ходе эволюции прокариоты выработали способы защиты своего генетического материала от повреждающего действия облучения, химических веществ и других мутагенов. В их клетках обнаружены эффективные системы ремонта поврежденных участков ДНК. Если бы таких механизмов не было, то организм бы переродился и вымер как вид.

Основной механизм восстановления ДНК — это “вырезание” повреждений, так называемая рестрикция. Ее осуществляют ферменты эндонуклеазы, расщепляющие нить ДНК. Такой способ помогает, только если повреждена только одна цепочка молекулы. Тогда поврежденный участок вырезается, а образовавшаяся брешь заполняется комплементарными нуклеотидами с использованием в качестве матрицы-шаблона неповрежденной нити ДНК.

Таким образом, многие случайные мутации попросту вырезаются.

Однако когда повреждение касается обеих нитей, тот же самый механизм восстановления превращается в орудие самоубийства: эндонуклеазы распознают поврежденный участок и разрывают в его месте обе нити ДНК. Кстати говоря, то же самое происходит и в клетках многоклеточных организмов в случае фатального повреждения хромосом. Такое генетически запрограммированное самоубийство биологи называют апоптозом. Оно сохраняет «чистоту генов» и предохраняет вид от деградации. Можно сказать, что клетка руководствуется своеобразным “клеточным самурайским законом” — “лучше умереть, чем ошибиться!”

Однако присущий всем живых существам инстинкт самосохранения порой все же берет верх, и клетке-мутанту удается “обмануть” убийственную рестрикцию путем модификации ДНК — метилированием или введением дополнительных пар нуклеотидов. Уцелевшая клетка приобретает новые свойства и, если они оказываются выгодными, дает начало новому виду существ.

Итак, огромное разнообразие организмов объясняется мутациями. Но, как оказалось, тому есть и другие причины. С развитием генетики ученые обнаружили, что для прокариот характерен путь горизонтального переноса генов между различными особями. Молекулярно-генетический анализ показал, что геномы прокариот представляют собой мозаику генов, приобретенных у разных видов. Одинаковые генетические последовательности можно увидеть у многих прокариот, вне зависимости от степени их родства. Объяснить возникновение такой мозаики может только горизонтальный перенос генов.

Горизонтальный перенос генов у прокариот — это не просто лабораторный артефакт или результат генной инженерии, а распространенное природное явление.

Установлены три основных механизма латерального переноса: трансформация, коньюгация и трансдукция.

Трансформация — это нормальная физиологическая функция обмена генетическим материалом у некоторых бактерий.

Конъюгация имеет наименьшее число ограничений для межвидового обмена генетической информацией, но предполагает тесный физический контакт между микроорганизмами, легче всего достижимый в биопленках.

Трансдукция (от лат. transductio — перемещение) — это перенос генетического материала из одной клетки в другую с помощью некоторых вирусов (бактериофагов), что приводит к изменению наследственных свойств клетки-реципиента. Явление трансдукции было открыто американскими учеными Д. Ледер- бергом и Н. Циндером в 1952.

Последний механизм следует рассмотреть более подробно, но прежде скажем несколько слов о вирусах.

Вирусы (от лат. virus — яд) были открыты в 1892 г. русским уче- ным-ботаником Д. И. Ивановским при изучении мозаичной болезни (пятнистости листьев) табака. К наиболее опасным заболеваниям, вызываемым вирусами у животных и человека, относят бешенство, оспу, грипп, полиомиелит, СПИД, гепатит и др.

Вирусы — существа совершенно удивительные. Они занимают промежуточное положение между живой и неживой материей, представляя собой случай некого биологического дуализма. На вопрос “живые ли вирусы?” нельзя ответить однозначно, ведь если живой считать структуру, способную к размножению и обладающую наследственной информацией, то можно сказать, что вирусы живые (впрочем, по этому определению живыми можно признать и компьютерные вирусы). Но если считать живой структуру, обладающую клеточным строением (как, например, растения, грибы, животные), то ответ должен быть отрицательным. Следует также отметить, что вирусы не способны воспроизводить себя вне клетки-хозяина.

Вирусы устроены очень просто. Они состоят из головки (сердцевины) округлой, гексагональной или палочковидной формы диаметром 45-140 нм и отростка толщиной 10-40 и длиной 100-200 нм. В 1 мм3 воды может уместиться около миллиарда фагов.

Рис 187. Электронно-микроскопическая фотография и схема строения бактериофага T4

Сердцевина вируса содержит ДНК или РНК. Ее окружает защитная белковая оболочка (капсид). Отросток имеет вид полой трубки, окруженной сократительными белками вроде мышечных.

На конце отростка у многих вирусов есть базальная пластинка, от которой отходят тонкие длинные отростки-«но- ги», служащие для прикрепления к клетке-хозяину.

Вирус может воспроизводить себе подобных только внедряясь в клетку хозяина. Для этого он прикрепляется к бактериальной клетке и растворяет клеточную стенку, выделяя особый фермент. Затем содержимое головки по канальцу отростка проникает в клетку. Попав внутрь клетки, вирус, подобно своему компьютерному собрату, перепрограммирует рибосомы на производство своих копий. Он «выключает» хозяйскую ДНК и, используя свою собственную ДНК или РНК, «заставляет» клетку синтезировать новые копии вируса. После сборки большого числа вирусных частиц клетка, как правило, погибает, а множество новых вирусов, произведенных с ее помощью, выходит на свободу, поражая другие клетки. Вирусы, вызывающие гибель клетки, называют вирулентными19.

19 Вирулентность — это степень болезнетворного действия микроба. Ее можно рассматривать как способность адаптироваться к организму хозяина и преодолевать его защитные механизмы.

Однако существует и другая категория вирусов, называемых умеренными (симбиотическими). Проникая внутрь клетки, они могут либо повести себя как обычные фаги, вызывая гибель клетки, либо могут встроиться в ДНК клетки-хозяина и остаться в ней в скрытой неинфекционной форме.

Клетки, содержащие такой вирус, называются лизогенными, они могут содержать 2, 3 и более фагов. Лизогения может затем передаваться потомству бактерии. На рисунке показаны два возможных пути развития умеренного вируса.


Рис 189. Жизненный цикл умеренного фага. Когда он инфицирует клетку, развитие может пойти

по литическому или лизогенному пути

Так, а что же наш «горизонтальный перенос»? Напоминаем, что трансдукция — это перенос вирусом бактериальных генов из одной клетки в другую, что приводит к изменению наследственных свойств клетки-реципиента.

Трансдукция возможна, если в процессе размножения умеренного фага одна из частиц вирусной ДНК случайно захватит фрагмент бактериальной хромосомы

НАНОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ ВСЕХ

Когда впоследствии такой вирус заражает другую бактерию, участок бактериальной ДНК проникает в клетку таким же путем, как вирусный. Между трансдуцированной ДНК и участком хромосомы может произойти обмен, и как следствие его возникают рекомбинанты, несущие небольшую часть генетического материала клетки-донора.


Рис 190. Схема общей трансдукции между линиями Е. coli:

а)              Клетка дикого типа, инфицированная фагом P1;

б)              ДНК клетки-хозяина деградирует в ходе литического цикла;

в)              в ходе сборки фаговых частиц некоторые фрагменты бактериальной хромосомы включаются в несколько фагов-потомков, что потом приведет к трансдукции;

г)              лизис;

д)              трансдуцирующий фаг инфицирует бактерию-реципиента;

е)              происходит обмен донорного гена а+ и реципиентного гена а-;

ж)              образование стабильного трансдуктанта а+.

Итак, мы рассмотрели процесс естественного “горизонтального” обмена генетической информацией между бактериями, то есть перемещения генов из одного организма в другой

посредством мобильных генетических посредников. Рассмотренный механизм получил название трансдукции, а понимание его сути привело к рождению генной инженерии.

Как уже было сказано, суть генной инженерии заключается в том, что в генотип организма встраиваются или исключаются отдельные гены или их группы. Для этого используют метод получения рекомбинантных, т. е. содержащих чужеродный ген, ДНК, которые затем вводятся в организм реципиента и становятся составной частью его генетического аппарата.

Этот процесс состоит из нескольких этапов: Чтобы выделить тот или иной ген из цепочки ДНК, используется рестрикция — разрезание ДНК на фрагменты уже знакомыми нам ферментами-рестриктазами. Они попросту «шинкуют» ДНК: режут на отрезки, но не как попало, а в определенных местах. Всякая рестриктаза может опознать лишь одну стандартную последовательность из нескольких нуклеотидов. Молекулы рестриктазы химически связываются с ними и в этих местах рвут цепь ДНК. На рисунке изображена схема расщепления ДНК по остаткам А (аденин).

Рис 191. Схема получения фрагментов ДНК в результате расщепления по определенному нуклеотиду (А)

В настоящее время известно более 400 рестриктаз, способных расщеплять ДНК по 120 различным последовательностям нуклеотидов. Лигирование — процесс «сшивания» генов с помощью особых ферментов, называемых лигазами. Лигазы сшивают участки ДНК, образовывая между их крайними нуклеотидами химическую связь.

После того как рекомбинантная ДНК сшита, ее вводят в живые клетки. Этот процесс называется трансформацией. Для того, чтобы рекомбинантная ДНК стала частью генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться в ее геном и реплицироваться за ее счет, либо быть способной к автономной репликации. Для этого используют векторы — мобильные генетические элементы: вирусы, плазмиды и транспозоны. Эти элементы могут присоединять те или иные гены к своей ДНК, а затем, оказавшись в клетке-хозяине, встраиваться вместе с «оторванным» чужеродным геном в хромосому хозяина, которая потом реплицируется уже вместе со всей этой новой последовательностью. В общих чертах это напоминает трансдукцию, имеющую, как мы убедились, место и в природе.

Итак, мы познакомились с общими принципами искусственного конструирования молекул ДНК. Рассмотрим теперь несколько примеров практического применения генной инженерии.

Получение инсулина

Инсулин — гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и уровень сахара в крови. Его недостаток в организме приводит тяжелейшему заболеванию — сахарному диабету, самой распространенной форме заболеваний эндокринной системы. Самая тяжелая форма диабета, для лечения которой больному необходим инсулин, вызвана гибелью клеток, синтезирующих этот гормон.

Раньше инсулин могли выделять только из поджелудочной железы телят и свиней. Для получения 100 г кристаллического инсулина требовалось 800-1000 кг исходного сырья. Однако с развитием генно-инженерных методов в 1978 г. был получен штамм бактерий Е. coli (кишечной палочки), способных продуцировать инсулин. В ДНК бактерии был встроен человеческий ген, отвечающий за его синтез. Теперь почти весь инсулин в мире производят трансгенные бактерии.

Получение соматотропина

За синтез соматотропина (гормона роста человека) отвечает передняя доля гипофиза. Его недостаток приводит к гипофизарному нанизму — карликовости (в среднем 1 случай на 5000 человек). Пригодный для лечения людей соматотропин можно выделить лишь из гипофиза человека, поэтому раньше его получали из трупов, но в ничтожных количествах: гормона хватало лишь для лечения 1/3 случаев карликовости, и то лишь в развитых странах. Препарат, выделяемый из трупов, имеет некоторые специфические особенности, приводящие к тому, что у 30% больных, получавших препарат, против гормона вырабатывались антитела, что сводило на нет его биологическую активность.

Сейчас гормон роста синтезируют с помощью специально сконструированных бактерий Е. coli. Впервые такую бактерию удалось получить в 1979 году.

Получение интерферонов

В 1957 году в Национальном институте медицинских исследований в Лондоне было установлено, что клетки человека и животных, подвергнутые воздействию вируса, выделяют вещества, придающие непораженным клеткам устойчивость к вирусной инфекции. Они как бы препятствуют (интерферируют) размножению вирусов в клетке и поэтому были названы интер- феронами. Интерфероны помогают нашему организму бороться со множеством вирусных заболеваний.

Препараты на основе различных видов интерферонов используются как иммуномодуляторы — для нормализации и усиления иммунной системы, в т. ч. для лечения различных тяжелых заболеваний — острого вирусного гепатита, рассеянного склероза, остеосаркомы, миеломы и некоторых видов лимфом. Их применяют и для лечения меланом, ряда опухолей гортани, легких и мозга.

Традиционно интерфероны извлекали из крови человека. Из 1 л крови можно выделить всего 1 мкг интерферона, то есть примерно одну дозу для инъекции. На современном этапе ин- терфероны получают с помощью генетически модифицированных микроорганизмов. Удалось получить штаммы бактерий, способные синтезировать до 5 мг интерферона на литр бактериальной суспензии, содержащей примерно 1011 бактерий, что заменяет кровь 25 000 доноров.

Трансгенные животные

Применение методов генной инженерии в животноводстве позволяет повышать продуктивность животных (например, удои молока), сопротивляемость их организма к болезням и т. д. Животных, имеющих в своем геноме чужой ген, принято называть трансгенными. Благодаря переносу генов у трансгенных животных возникают новые качества, а дальнейшая селекция позволяет закрепить их в потомстве и создавать трансгенные линии.

Так, были получены животные-биореакторы, способные выделять ценные биологические вещества. Например, в России группой ученых под руководством Л. К. Эрнста была выведена трансгенная овечка, которая с молоком выделяет химозин — фермент, используемый в производстве сыра. Не так давно для сыроваренной промышленности требовалось огромное количество желудков телят. В последние несколько десятков лет практически все сыроделы пользуются химозином, полученным методом микробиологического синтеза из культур бактерий и микроскопических грибков. Очевидно, что такое получение химозина не только гуманнее, но и выгоднее традиционных способов, требующих убийства сотни телят. Всего из 3 л молока трансгенной овцы можно получить достаточно химозина для производства тонны сыра — и при этом не тратиться ни на работу ферментера, ни на выделение из культуральной жидкости нужного фермента и его очистку.

Другой пример — трансгенная корова, которая выделяет с молоком лекарственный препарат эритропоэтин, применяемый в терапии лейкозов. Ведутся исследования по получению многих других лекарств из молока животных. Применяемые для этого биотехнологические методы с использованием бактерий дороги и сложны. А трансгенные животные быстро размножаются, и выход полезных веществ с их молоком превосходит таковой у бактерий.

Другая важная задача — выведение животных, устойчивых к заболеваниям. Потери в животноводстве, вызванные болезнями, достаточно велики, но уже созданы популяции трансгенных коров и кур, устойчивых к некоторым паразитам.

Трансгенные растения

Тысячи лет люди выводят новые сорта растений путем отбора экземпляров с новыми свойствами, полученными в результате случайных мутаций. С начала ХХ века стали целенаправленно применять облучение и химические мутагены, слияния соматических клеток и т. д., а скрещивание и отбор стали проводить с учетом законов Менделя. При этих традиционных методах изменения непредсказуемы и обычно затрагивают многие гены.

Генноинженерные методы позволяют создавать новые генотипы и, следовательно, новые формы растений гораздо быстрее, чем классические методы селекции. Кроме того, появляется возможность целенаправленного изменения генотипа.

Генная инженерия позволяет вводить в растения гены устойчивости к различным стрессовым факторам, фитопатогенам, гербицидам и пестицидам, гены скороспелости, фиксации азота и др. Возможно также и улучшение аминокислотного состава белков растений.

Наибольший урон растениям наносят грибные, бактериальные и вирусные инфекции. В природе растения обладают защитными механизмами, которые начинают действовать в ответ на проникновение фитопатогенов в клетку. Во-первых, начинается синтез веществ, убивающих патогены. Во-вторых, создаются барьеры, препятствующие распространению инфекции.

Применение методов генной инженерии, использующих естественные защитные механизмы, позволяет получать трансгенные растения, устойчивые к грибной, бактериальной и вирусной инфекции. В частности, были получены трансгенные культуры табака и турнепса, в состав генома которых ввели ген хитиназы, а также томаты с геном защитных пептидов редьки, отвечающих за устойчивость к фитопатогенным грибам.

Другой подход к получению растений, устойчивых к вирусной инфекции, состоит во введении в геном исходных растений генов, кодирующих белок оболочки вируса. Это приводит к блокировке размножения вируса и снижению инфицирован- ности. Благодаря такому подходу был получен стойкий антивирусный эффект у табака, модифицированного геном оболочки вируса табачной мозаики.

Интересный эффект дало введение в геном растений гена человеческого интерферона JFN — одного из ключевых белков нашего иммунитета. Ген этого интерферона был введен в растения турнепса, табака, картофеля, что повысило устойчивость этих растений к вирусным заболеваниям.

Создание трансгенных растений, устойчивых к насекомым, с помощью методов генной инженерии стало возможным после того, как было обнаружено, что почвенные бактерии Bacillus thurengiensis синтезируют специфический белок, токсичный для насекомых. Ген, ответственный за его синтез, удалось выделить и ввести в геном многих видов сельскохозяйственных растений. Для человека и животных этот белок безопасен, и даже на насекомых разные его варианты действуют по-разному. Различные модификации Bt-токсина могут быть ядовитыми только для жуков, или только для бабочек определенного отряда, и т. д.

В природе растения приспосабливаются к неблагоприятным условиям среды различными способами. Во-первых, это физиологические механизмы, позволяющие растениям избежать неблагоприятных воздействий (например, опадание листвы осенью при снижении температуры). Во-вторых, адаптация с помощью морфологических приспособлений: толстый слой кутикулы на листьях, уменьшение листовой поверхности (прорези), ее опушение, которые предотвращают излишнюю потерю влаги растениями. В-третьих, негативное влияние внешней среды может быть преодолено с помощью изменений метаболизма. Например, при засухе или чрезмерной концентрации солей в почве и воде у высших растений основным защитным механизмом, связанным с изменением метаболизма, является накопление в клетках осмопротекторов.

Именно этот адаптационный механизм наиболее доступен для генноинженерных исследований. Эксперимент показал, что стрессовый ответ на избыток солей или недостаток влаги у бактерий и высших растений выражается сходно: и те, и другие начинают усиленно синтезировать белки-осмопротекторы для восстановления осмотического баланса между цитоплазмой и окружающей средой. Поэтому для создания устойчивых к засухе и засолению растений в их геном были введены соответствующие бактериальные гены. Полученные трансгенные растения могли расти в засушливой почве при концентрации соли в среде 20 г/л.

Адаптация к низким температурам сопряжена у бактерий и высших растений с накоплением веществ, понижающих осмотический потенциал клеток и уменьшающих вероятность образования крупных кристаллов льда, способных вызвать их гибель просто из-за разрушения клеточной оболочки. Вот почему случайные заморозки способны уничтожить большинство сельскохозяйственных культур.

Чтобы не допустить образования льда в клетках, уже давно применяется заражение растений мутантным штаммом бактерии Pseudomonas syringae. Полученные таким образом растения легко переносят заморозки вплоть до —8°С.

Однако оказалось, что бактерии мутантного штамма более живучи и могут вытеснить природный штамм этих бактерий, который, попадая в верхние слои атмосферы, способствует кристаллизации атмосферной влаги. Вероятно, вытеснение природного штамма могло бы привести к изменению климата и экологической катастрофе.

<< | >>
Источник: Мария Рыбалкина. НАНОТЕХНОЛОГИИдля всех. 2005

Еще по теме Основные механизмы генной инженерии:

  1. 4.2. Глобализация и модернизация как факторы современного цивилизационного развития
  2. 4.2. Глобализация и модернизация как факторы современного цивилизационного развития
  3. ФИЛОСОФИЯ ИСТОРИИ
  4. 17. О нашем поражении
  5. ЧЕЛОВЕК И МЕГАТЕНДЕНЦИИ ГЛОБАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ В XXI ВЕКЕ
  6. «Ленем (штат Мэриленд).
  7. Кризис пролетарского социализма в СССР
  8. У опасной черты
  9. Глава 15 ОБЫДЕННОЕ И НАУЧНОЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ СОЗНАНИЕ
  10. Глава 22 ГЕОГЛОБАЛИСТИКА
  11. § 1. Проблема природы наследственности и изменчивости в становлении генетики
  12. КАЗАХСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТим. АЛЬ-ФАРАБИ - ВЕДУЩИЙ НАУЧНЫЙЦЕНТР КАЗАХСТАНА
  13. ТЕХНОЛОГИЯ
  14. Инновационные и предпринимательские университеты
  15. Генетически модифицированные продукты:аргументация в категориях Добра и Зла
  16. Медицина и фармацевтика
  17. Индикаторы развития институционально-технологической инфраструктуры