Глава IX. Раздел 6 Конфокальная микроскопия.

Вторая особенность состоит в том, что осветитель создает не равномерную освещенность поля зрения, а фокусирует свет в анализируемую точку, как показано на рис. 9.6.1

б.              Это может достигаться расположением второй фокусирующей системы за образцом, но при этом требуется, чтобы образец был прозрачным. Кроме того, объективные линзы обычно сравнительно дорогие, поэтому использование второй фокусирующей системы для подсветки мало предпочтительно. Альтернативой является использование светоделительной пластинки, так чтобы и падающий и отраженный свет фокусировались одним объективом. Такая схема к тому же облегчает юстировку. Качественно понятно, что применение конфокальной схемы должно приводить к увеличению контрастности изображения, за счет того, что "паразитный" свет от точек соседних с анализируемой перестает попадать в детектор. Платой за увеличение контрастности будет необходимость применения достаточно сложных схем сканирования либо образцом, либо световым пучком.

Идея создания микроскопа, особенно востребованного биологами, поскольку он способен на клеточном уровне показать прижизненный срез живой ткани, активно разрабатывалась еще 130 лет назад. Основной элемент современных микро-

скопов был разработан в конце 19 века и представлял собой вращающийся диск с мельчайшими отверстиями, позже названный по имени своего изобретателя Нип- ков диск. Принцип изобретения состоял в возможности света, проходя через мельчайшие отверстия в диске и увеличительную линзу, проникать в глубину ткани и освещать фрагмент клетки на удалении от поверхности. При быстром вращении диска фрагменты складывались в общую картинку. За счет удаления или приближения конструкции к объекту варьировалась и глубина оптического среза исследуемой ткани.

Назначением конфокального микроскопа является получение увеличенных изображений микрогеометрии поверхности и внутренней микроструктуры непрозрачных и полупрозрачных объектов в биологии, полупроводниковой микроэлектронике, интегральной оптике, геологии, химии и т.д. В 1955 году Марвин Минский создал первую опытную рабочую модель подобного микроскопа, кроме переработанного нипков диска в схеме прохождения света были применены две оптические линзы, связанные и, одновременно, взаимодействующие друг с другом, что и легло в название микроскопа (конфокальный т.е. основанный на взаимодействии оптик).

Схема микроскопа приведена на рис. 9.6.2., на котором 1 - источник излучения; 2,6 - игольчатые диафрагмы;              3,5              -

объективы; 4 - сканирующий координатный

стол; 7 - приемник излучения.

В микроскопе Минского были частично устранены причины, затрудняющие просматривать детали объёмного препарата на некоторой его глубине из-за рассеяния и преломления светового потока, на оптически неоднородных фрагментах. Повысить контрастность наблюдаемого участка удалось благодаря фокусировки луча в глубине препарата и использованию специальной игольчатой диафрагмы расположенной вблизи плоскости регистрации (pinhole).

вания по оси Z; выбор увеличения электронным способом; возможность количественного исследования оптических свойств препаратов; возможность применения различных способов микроскопирования: тёмное поле, фазовый контраст, интерференционный контраст; возможность использования простых объективов из-за фокусировки луча в точку. Весьма впечатляющий перечень преимуществ по сравнению с обычной оптической микроскопией. Эти возможности конфокального микроскопа обеспечивали послойное наблюдение фрагментов ткани с последующей трёхмерной реконструкцией изображения.

Поскольку наличие диафрагмы является основным отличием конфокального микроскопа от обычного, то вполне очевидно, что ее параметры являются определяющими. Основной из параметров - это размер диафрагмы в фокальной плоскости облучающей и собирающей линз. Предполагается, что источник излучения является точечным, что позволяет получить функцию размытия точки (PSF) для обычного и конфокального микроскопа. Полученные PSF описывают свойства объективной линзы, а изображение диафрагмы в плоскости объекта определяет, свет из каких областей регистрируется фотодетектором. Очевидно, однако, что уменьшение размера диафрагмы приводит к уменьшению количества проходящего света, увеличивает уровень шума и, в конечном итоге, может свести на нет все достигнутые преимущества по контрастности. Таким образом, стоит вопрос об оптимальном выборе размера диафрагмы и разумном компромиссе.

Диафрагма с отверстием меньше размера пятна Эйри просто приводит к потере интенсивности и никак не влияет на разрешение. Диафрагма размером в одно пятно Эйри позволяет по максимуму использовать разрешающую способность объективной линзы.

В первом микроскопе результаты исследования фиксировались на фотопленку. С развитием телевидения и появлением телевизионных мониторов в середине 60-х годов прошлого века прошла первая волна конструирования конфокальных микроскопов и бум описательных работ по строению и функционированию тканей. К сожалению, технические возможности того времени не позволяли бороться с помехами изображения, происходящими из-за малых скоростей сканирования, ручной настройки и слабости световых источников. Основную же проблему составляли сложности регистрирования полученных результатов на кинопленку. Только с появлением видеомагнитофонов в 80-х и компьютеров, способных обрабатывать изображения, в начале 90-х годов появилась реальная возможность создать и эффективно применить те современные микроскопы, используемые в наше время.

Принцип работы конфокального лазерного микроскопа основан на непосредственном сканировании исследуемого объекта субмикронным лазерным зондом, который формируется при помощи уменьшающей оптической системы. Сканирование производится с помощью двухкоординатного зеркального сканатора. Отличительной особенностью конфокального режима является использование точечного детектора, размер которого определяется конфокальной диафрагмой, расположенной в плоскости, оптически сопряженной с фокальной плоскостью микрообъектива (объекта). Вследствие этого на фотодетектор попадает только световое излучение от точек объекта, а излучение от точек, лежащих вне фокальной плоскости, практически не дает вклада в полезный сигнал.

Теоретические основы метода были разработаны в 1977 году, а первые установки были сконструированы спустя еще два года.

Конфокальная микроскопия и созданные на ее основе конфокальные лазерные сканирующие микроскопы (КЛСМ) - принципиально новое направление в световой микроскопии. С возникновением методов конфокальной сканирующей микроскопии появилась возможность путем послойного сканирования просматривать детали объемного образца на некоторой его глубине, что не позволяет делать обычный, даже самый совершенный микроскоп из-за рассеяния и преломления света на оптически неоднородных фрагментах.

Конфокальный микроскоп практически не отличается от флуоресцентного микроскопа. Если в объективе обычного микроскопа изображение можно увидеть просто глазом, то в конфокальном микроскопе изображение формируется только на экране компьютера. Область фокусировки в конфокальном микроскопе примерно на порядок меньше, за счет того, что диафрагма на приемнике имеет очень маленькую апертуру.

Существенным моментом является также как можно меньший диаметр диафрагмы детектора. Это достижимо при использовании достаточно мощных источников освещения, какими являются лазеры. Сочетание этих особенностей позволяет значительно увеличить разрешение (до 100-200 нм) и контрастность по сравнению с обычной световой микроскопией. Кроме того, в случае флуоресцентной КЛСМ, лишь только та флуоресценция, которая возникает в той части образца, на которую сфокусирован объектив, достигает детектора и регистрируется. В обычной же световой люминесцентной микроскопии детектируется флуоресценция из всей освещенной части образца, хотя те части, которые находятся вне фокуса, видны неконтрастно. Благодаря этим особенностям КЛСМ появляется возможность

послойно просматривать различные объекты и количественно характеризовать их флуоресцентные изображения.

Предметный столик передвигается в плоскости латерально и по вертикали. Каждое полученное изображение запоминается компьютером, по этим изображениям компьютер воссоздает изображение каждого оптического среза, а также, при необходимости, любого вертикального среза, что совершенно невозможно для обычной световой микроскопии. Количественные характеристики можно получать определяя интенсивность флуоресценции с помощью ФЭУ из выделенных окон на изображении. Например, можно выделить квадратное окно размером 5х5 мкм в интересующей части получаемого флуоресцентного изображения и определить интенсивность флуоресценции, испускаемой клеткой только из этого окна.

Разрешающая способность определяет пределы различимости деталей изображения и по этому является одной из главных характеристик любого микроскопа. В обычном микроскопе и КЛСМ механизмы формирования изображения различны, и это различие косвенно находит выражение в значение разрешающей способности. Оценивается разрешающая способность по характеру дифракционных явлений, возникающих при микроскопировании близкорасположенных точечных светящихся объектов. Критерии её оценки основаны на анализе функции рассеивания точки. Для качественного описания разрешения оптических приборов используются различные критерии - Рэлея, Спарроу, Дау, Шустера и т.д.. Наиболее распространены в применении к микроскопии критерии Рэлея и Спарроу.

Критерий Рэлея формулируется следующим образом: две точки различимы если в картине распределения интенсивности средние точки между ними имеется провал на 26,5 % от максимального значения. Он предполагает, что разрешение микроскопа определяется расстоянием между двумя некогерентными источниками света, при котором максимум отклика на один источник освещения совпадает с первым нулём отклика на другой. Разрешение по Рэлею численно равно радиусу диска Эри и для обычного микроскопа равно:

где ds(R)- разрешение по Рэлею для стандартного микроскопа, X - длина волны источника в нм, NA - числовая апертура. Использование в КЛСМ точечной диафрагмы размеры которой согласованы с увеличением микроскопа и длиной волны, даёт возможность повысить разрешение немногим более чем на 1о%. Очевидно, что разрешение КЛСМ и соответственно возможности анализа тонких структур могут превышать аналогичные возможности обычного микроскопа, не более чем на 40% в условиях сканирования препарата тонким лучом.

Разрешающая способность КЛСМ от способа микроскопирования и освещения. Разрешение КЛСМ определяется как оптической системой, так и электронным

трактом обработки информации. По этому в конструкции КЛСМ, его схемах должны быть согласованы такие параметры, как разрешение оптической системы, шаг сканирования, характеристики детектора, а так же выбранные оптимальные алгоритмы обработки и соответствующее программное обеспечение.

Главная особенная КЛСМ по сравнению с обычным микроскопом состоит в том, что при дефокусировке препарата изображения его фрагментов, лежащие выше и ниже фокальной плоскости вдоль оси Z, не попадают на детектор благодаря применению игольчатой диафрагмы. В обычном световом микроскопе при смещении плоскости препарата относительно фокальной плоскости препарата относительно фокальной плоскости детали изображения теряют резкость и яркость, вследствие чего изображение становиться неясным и размытым. В конфокальном лазерном микроскопе они исчезают, поэтому параметры игольчатой дипфрагмы являются определяющими. Выбор оптимального диаметра игольчатой диафрагмы важен для получения требуемых характеристик прибора. Реально размер игольчатой диафрагмы конечен, и от него зависят поперечное разрешение прибора, яркость освещённых элементов препарата, смещённых относительно фокальной плоскости по оси Z, и глубина резкости.

При малых размерах диаметра игольчатой диафрагмы световой поток становится малым, что уменьшает отношение сигнал/шум и снижает контрастность. При больших диаметрах эффективность игольчатой диафрагмы снижается за счёт уменьшения апертуры. Как правило, в современных конфокальных микроскопах игольчатые диафрагмы размещены на вращающемся барабане и имеют размеры 26-8-10-20-40-100 мкм. Выбор размера отверстия определяется скоростью сканирования, структурой объекта, апертурой и увеличением объектива, параметрами ФЭУ и рядом других факторов. Набор диафрагм установлен в поворотном диске. Выбор нужной диафрагмы определяется автоматически с помощью шагового двигателя. Поворотный диск устанавливается в измерительном модуле с возможностью юстировки по оси прибора и перпендикулярно ей. Ориентировочно можно считать, что в КЛСМ глубина резкости приблизительно в 1.4 - 1.5 раза меньше, чем у обычного микроскопа, а латеральное разрешение в том же соотношении выше. Оптимальное значение диафрагмы можно приблизительно определить по формуле:

где М - полное увеличение микроскопа. Если глубина резкости лежит в пределах величин от 0.162 до 0.414 мкм в зависимости от размеров отверстия игольчатой диафрагмы и апертуры объектива, то в этом диапазоне удаётся получить послойное изображение объектов. Шаг по высоте может составить 50 мкм и более.

Раздел 1. Применение нанотехнологии в биологии, медицине и экологии.

Новым направлением в нанохимии является синтез и использование систем, состоящих из наночастиц металлов (в основном золота и серебра) и различных биомолекул: ДНК, пептидов, олигонуклеотидов. С этим связан новый метод введения биоматериалов в живые клетки, основанный на электрораспылении частиц металла, несущих большой электрический заряд и имеющих высокую скорость. Если металлические частицы, поверхность которых покрыта генами, диспергировать, то они дезинтегрируются в жидких каплях под влиянием внешнего неоднородного поля. Получаемые при этом фрагменты гена обладают зарядом того же знака, что и частицы металла, характеризуются высокой концентрацией и могут внедряться в живую клетку. Вопрос о том, к чему это может привести совершенно никого не волнует, а зря.

В качестве новых контрастных материалов для магнитно-резонансных исследований в медицине предложено применять наночастицы с примесью ионов гадолиния. Такие частицы диаметром 120 нм достаточно малы и могут легко проникать в кровеносные сосуды.

Ведутся разработки по применению биомолекул для распознавания распространенных неорганических материалов. Это можно сделать, используя принципы селективного связывания, известные в молекулярной биологии. Применение специфического связывания пептидов с различными полупроводниками для создания нанокристаллических ансамблей показало, что с помощью нанокристаллических полупроводников можно выделить определенные пептиды, так как последние с высокой специфичностью связываются с поверхностью этих полупроводников. В качестве субстратов использовались пять различных поверхностей монокристаллов полупроводников: GaAs (100), GaAs (111) (на поверхности атомы галлия), GaAs (111) (на поверхности атомы мышьяка), InP (100) и Si (100). Было обнаружено, что из большого числа случайно взятых пептидов каждый субстрат выбирается и селективно связывается с определенной аминокислотной последовательностью.