Методические аспекты исследования алкалофильныхи галофильных почвенных актиномицетов
Для выделения и дифференцированного учета актиномицетов использовали метод посева из разведений почвенных суспензий на плотные питательные среды и метод «рассыпки» почвенного мелкозема на поверхность плотной питательной среды в чашке Петри (Методы почвенной микробиологии..., 1991).
Для выделения актиномицетов из засоленных и щелочных почв использовали следующие среды: среду Гаузе 1 (Гаузе и др., 1983) и модифицированную среду Гаузе 1 с 5%-ной концентрацией солей MgCl2 и Na2S04 следующего состава (г/л): К2НРО4-0,5; Na2S04- 50; KNCgt;3-1,0; MgCl2- 50; FeSO4-0,01; крахмал-20,0; агар-агар-20,0; среду с пропионатом натрия (Зенова, 2000) и модифицированную среду с пропионатом натрия с 5%-ной концентрацией солей NaCl и MgS04. Использовали среды со значениями pH 5,3; 7,2; 8,0 или 9,0, которые обеспечивали и поддерживали с помощью фосфатной и фосфатно-цитратной буферных смесей. В среды добавляли нистатин (50 мкг/мл) для ограничения роста грибов и налидиксовую кислоту (5 мкг/мл) для ограничения роста стелющихся бактерий. Инкубацию посевов вели при 28°С 10 сут на среде Гаузе 1 или в течение трех недель (14 сут при 28°С, далее при комнатной температуре) - на среде с пропионатом натрия. Дифференцированный учет актиномицетов проводили при микроскопировании колоний в оптическом микроскопе (хбОО). Выделяли несколько морфотипов, подсчитывали число колоний, относящихся к определенному морфотипу, выделяли в чистую культуру представителей каждого морфотипа. Для выделения культур использовали среду овсяный агар (Гаузе и др., 1983).Оптимальные и ограничительные для роста культур стрептомицетов, выделенных из засоленных почв, концентрации NaCl и значения pH среды определяли по величине радиальной скорости роста колоний на плотной питательной среде Гаузе-1 с концентрацией NaCl 1-8% (шаг 1%), и значениями pH среды 4.0-10.0 (шаг 1.0). Расчет радиальной скорости рорта колонии Кг проводили по формуле:
Kr = (d2-d1)/(t2-t1),
где dj и d2 - диаметр колонии в начальный и конечный моменты измерения соответственно, мм; U и t2 - время начального и конечного измерения, сут.
Измерения проводили в 20 - кратной повторности.
В лабораторных исследованиях для проведения модельного опыта по изучению динамики численности и биомассы почвенных актиномицетов в ходе инициированной микробной сукцессии навеску воздушно-сухой почвы (20 г), освобожденную от крупных корешков и посторонних включений, растирали в фарфоровой ступке и просеивали через сито в 1 мм. Почву помещали в чашки Петри, тщательно перемешивали и увлажняли до 60% от полной влагоемкости. Инкубировали чашки с почвой при поддержании указанного уровня влажности при 20°С в эксикаторах, которые открывали на 30 минут через день. Посевы почвенных образцов производили в момент инициации сукцессии (0-момент), на 3, 7, 15, 25, 35-е сут после инициации сукцессии. Длину мицелия актиномицетов в почве определяли с помощью люминесцентного микроскопа. Для окрашивания мицелия использовали водный раствор акридина оранжевого (разведение 1 х 10000; 2-4 мин). Длину мицелия в 1 г почвы вычисляли по формуле:
М = (4 an/р) х Ю10,
где М - длина мицелия в 1 г почвы; а - средняя длина Мицелия в поле зрения; р - площадь поля зрения (мкм2); п - показатель разведения.
При расчете биомассы учитывали, что 1 м сухого актиномицетного мицелия диаметром 0,5 мкм имеет биомассу 3,9 х 10‘8 г (Методы почвенной микробиологии..., 1991).
Наблюдение за развитием галоалкалофильного стрептомицета Streptomyces ramulosus шт. 117-2 проводили на среде Гаузе 1 с различными значениями pH (7,0 и 8,0) и различными концентрациями солей (MgCl2 и Na2S04, 0,02% и 5%), исследуя под микроскопом мицелий и споры. Покровные стекла помещали под углом к поверхности агаризованной среды с растущей культурой (Определитель бактерий Берджи, 1997). После инкубации покровные стекла вынимали и рассматривали в оптическом микроскопе (х 900). Описание проводили на 3-е, 5-е и 7-е сутки опыта.
Предварительную принадлежность исследуемых актиномицетов к роду
Streptomyces определяли, согласно определителям (Определитель бактерий
88
Берджи, 1997; Bergey’s manual, 1989) по следующим морфологическим и хемотаксономическим признакам: наличие воздушного и субстратного
мицелия, отсутствие фрагментации мицелия, наличие цепочек спор только на воздушном мицелии; присутствие в гидролизатах целых клеток LL- изомера диаминопимелиновой кислоты (LL-ДАПк) и отсутсвие дифференцирующих сахаров.
Предварительную принадлежность исследуемых актиномицетов к роду Micromonospora - по наличию одиночных спор на субстратном мицелии, отсутствию воздушного мицелия или слабое развитие стерильного воздушного мицелия, наличие в гидролизатах целых клеток мезо-ДАПк, ксилозы, арабинозы.Для видовой идентификации стрептомицетов использовали
фенотипические и генетические показатели согласно определителям (Гаузе и др., 1983; Определитель бактерий Берджи, 1997).
Определяли интенсивность прорастания спор и роста мицелия стрептомицетов при разной влажности. Для создания разных уровней влажности использовали два метода.
В первом методе влажность воздуха создавали в эксикаторе с раствором определенной соли. Использовали три уровня влажности: (табл. 7): 1) aw 0,50, (-96,4 МПа), (50% ОВ) - экстремально низкая влажность для развития живых организмов; 2) aw 0,86, (-22,6 МПа), (86% ОВ) - уровень давления влаги, соответствующий максимальной адсорбционной
влагоемкости (МАВ); 3), 3) aw 0,98, (-2,8 МПа), (98% ОВ) - уровень давления влаги, приближенный к полевой влагоемкости (ПВ).
Для приготовления препаратов моноспоровые суспензии стрептомицетов (105 кл./мл), (1 капля, распределенная на площади 1см2) наносили на предметные стекла, подсушивали до воздушно-сухого состояния и просчитывали среднее число спор в поле зрения (микроскоп Axiostar, хЮОО). Стекла помещали в эксикаторы, где были созданы определенные уровни влажности воздуха, и инкубировали в термостате при 28°С.
Соотношение основных единиц измерения влажности
Таблица 7
| Активность воды (а*) | Относительная влажность (ОВ %) | Давление влаги (мегапаскали, МПа) | Потенциал почвенной влаги (атм) | Насыщенный раствор соли в эксикаторе |
| 0,98 | 98 | -2,8 | ” -27,6 | K2S04 |
| 0,86 | 86 | -22,6 | -223,0 | КС1 |
| 0,50 | 50 | -96,4 | -961,5 | Ca(N03b |
Для приготовления препаратов моноспоровые суспензии стрептомицетов (105 кл./мл), (1 капля, распределенная на площади 1см2) наносили на предметные стекла, подсушивали до воздушно-сухого состояния и просчитывали среднее число спор в поле зрения (микроскоп Axiostar, хЮОО).
Стекла помещали в эксикаторы, где были созданы определенные уровни влажности воздуха, и инкубировали в термостате при 28°С.Уровень влажности воздуха в эксикаторах контролировали цифровым термовлагометром Viking АВ с погрешностью измерения влажности воздуха не более 1 %. Стекла просматривали под микроскопом через 8, 24 и 72 ч экспозиции в эксикаторе.
Подсчитывали число проросших спор (число спор с ростовыми трубками) и длину проростков мицелия. Просмотренное стекло назад в эксикатор не помещали, и следующее определение проводили на стекле, остававшемся все время в эксикаторе.
Во втором методе использовали агаризованную среду с различными осмотическими давлениями влаги - метод, предложенный авторами статьи. Использовали среду глицерин-нитратный агар (Гаузе и др., 1983). Осмотическое давление создавали определенной концентрацией глицерина в среде. Предварительно строили кривую зависимости осмотического давления
от концентрации глицерина в среде. Опыты проводили при трех значениях
90
влажности: 1) aw 0,67, (-53,6 МПа), (67%ОВ), использовали 60% водный раствор глицерина; 2) а*, 0,86, (-22,6 МПа), (86% ОВ), использовали 40%
водный раствор глицерина; 3) aw 0,98 (-2,8 МПа), (98% ОВ), использовали 25%-ный водный раствор глицерина. Создание влажности ниже значения а* 0,67 с применением глицерина невозможно.
Определяли радиальную скорость роста колоний стрептомицетов на агаризованной среде с различным осмотическим давлением. Для этого споры стрептомицетов помещали с помощью стерильной препаровальной иглы на поверхность агаризованной среды в чашке Петри (посев методом «укола»). Чашки инкубировали в термостате 14 суток при 28°С в эксикаторах. Влажность в эксикаторах контролировали при помощи термовлагомера Viking АВ.
Измеряли диаметр колоний стрептомицетов под микроскопом с помощью окуляр-микрометра или под лупой с помощью штангенциркуля. Первое измерение проводили через 48 ч инкубирования, а затем через каждые двое суток.
Измерения проводили в 20-кратной повторности. 
В случае измерения роста макроколоний расчет проводили по формуле:
vK - скорость роста колоний актиномицетов
,
- радиус
колоний (мм), t] и t2 время начального и конечного измерений соответственно (ч).
В случае измерения роста микроколоний расчет проводили по формуле:
vK - скорость роста колоний актиномицетов - число клеток
окуляр-микрометра, занятых мицелием, t\ и t2 - время инкубации (ч), -
площадь одной клетки окуляр-микрометра (мкм2).
В случае, если к 14-м суткам роста не наблюдали формирования колоний стрептомицета, то просчитывали под микроскопом количество мест посева спор стрептомицета на чашках Петри (мест «уколов»), в которых наблюдалось прорастание спор (образование ростовых трубок), и рассчитывали процент «уколов» с проросшими спорами от всех «уколов» на чашках Петри. Прорастание спор в местах «уколов» определяли под микроскопом.
Оценивали степень развития стрептомицета при разной влажности по следующим показателям: наличие проросших спор; интенсивность ветвления проростков, образование микроколоний; формирование воздушного мицелия; формирование спор на воздушном мицелии.
Определяли динамику дыхания актиномицетов в среде с различным давлением влаги. Актиномицетов культивировали в пенициллиновых флаконах в жидкой глицерин-нитратной среде. Различные уровни давления влаги создавали, варьируя концентрацию глицерина в среде. Измеряли эмиссию СО2 во флаконах в газовой фазе над жидкость^ при помощи газового хроматографа. Условия определения СО2: детектор по
теплопроводности (катарометр), колонки с носителем с носителем Porapak-Q (0,3 х 350 см), газ-носитель гелий (25мл/мин), температура колонки 40°С (Степанов, Лысак, 2002).