2.3.4. Целлюлолитические ферменты и механизм их действия [22-30]

Субстратом для целлюлолитических ферменетов является целлюлоза. Целлюлолитические ферменты, разрушающие целлюлозу, синтезируются в основном грибами, относящимися к различным видам: Aspergillus amstelodamy, Aspergillus fumigatus, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Penicillium notatum, Rhizopus oryzae, Trichoderma lignorum, Trichoderma virida, Trichoderma koningii и многие другие.

Для более эффективного гидролиза целлюлозы можно использовать комплекс ферментов. Целлюлазный комплекс содержит 4 группы ферментов.

1. эндоглюконазы – 1,4-?-D-глюкан-4-глюкогидролаза (КФ 3.2.1.4), которая может неупорядочено гидролизовать в целлюлозе и в ?-глюканах зерна ?-1,4 связи и образовывать помимо целлоолигосахаридов глюкозу и целлотриозы;
2. экзо-1,4-?-D-глюканцеллобиогидролаза (КФ 3.2.1.91) – это целлобиогидролаза, которая отщепляет целлобиозу с нередуцирующих концов целлоолигосахаридов;
3. ?-D-глюкозид-глюкогидролаза (КФ 3.2.1.21) – это экзо-?-глюкозидаза, или целлобиаза, которая отщепляет концевые нередуцирующие остатки ?-D-глюкозы.
4. 1,4-?-D-глюкан-глюкогидролазы (КФ 3.2.1.74) – это экзо-1,4-?-глюкозидаза, которая отщепляет с концов глюкозные остатки.

Общую схему ферментативного гидролиза комплексом целлюлазных ферментов представляют следующим образом:

Эндоглюконазы – это глюкопротеиды, в состав которых входит до 40% глюкозы, маннозы, галактозы и арабинозы, ковалентно связанных с белковой частью молекулы. Считают, что углеводный компонент фермента взаимосвязан с его адсорбционной способностью. Молекулярная масса их составляет 12000-50000.

Для эндоглюконаз характерно возростание скорости каталитического гидролиза олигосахаридов с увеличением длины цепи молекулы от димеров до гекса- или гептамеров.

Предполагается, что активный центр эндоглюконаз содержит несколько сорбционных центров, ответственных за связывание моносахаридных остатков. Каталитический участок их активного центра обладает повышенным сродством к конформации «полукресло» глюкозил-катиона и состоит, по-видимому, из двух карбоксильных групп [22].

Механизм расщепления глюкозидной связи полисахарида ? лизоцима хорошо изучен, и на основании этих исследований обощён механизм действия лизоцима эндоглюконаз [22]. Предлагается следующая последовательность процессов ферментативного катализа эндоглюконазами: искажение конформации глюкозилпироназного кольца (способствует образованию карбокатиона), общий кислотно-основной катализ карбоксильной группой (включающий протонирование гликозильного кислорода и депротонирование акцептора) и стабилизация образующегося карбокатиона карбоксилат-анионом. Но механизм каталитического действия фермента может модифицироваться в зависимости от стереохимических особенностей реакции и структуры субстрата. Механизм деструкции полисахаридов эндо-ферментами до конца не решён и остаётся в стадии дискуссии.

Экзоглюконазы. Целлобиогидролазы ? глюкопротеиды, основным компонентом углеводной части которых является манноза. Молекулярная масса их составляет 30000-70000 Да.

Скорость гидролиза целлобиогидролазами растворимых целлоолигосахаридов возрастает с увеличением степени полимеризации субстрата от 3 до 6. На целлобиозу они не действуют. Это говорит о много - сайтовой структуре сорбционного участка активного центра целлобиогидролаз.

Целлобиазы (экзо-?-глюкозидазы) ? олигомерный белок с молекулярной массой 40000-400000 Да. Но многие ?-глюкозидазы относят к гликопротеидам и кислым белкам.

Для глюкозидаз характерна широкая специфичность. Они могут гидролизовать глюкозидные связи.

Экзо-1,4-?-глюкозидаза (экзоглюкозидазы) ? это гликопротеиды, содержащие до 9% нейтральных углеводов, состоящих в основном из маннозы, небольшого количества глюкозы и глюкозамина. Молекулярная масса их составляет 45000-90000. Они отличаются от целлобиогидролаз тем, что продуктом их действия являются моносахариды (глюкоза). Эти целлюлолитические ферменты наименее изученые.

Существует несколько моделей механизма действия целлюлолитического комплекса ферментов и невозможно выделить один из них. Дискуссии по этому вопросу продолжаются.

Целлюлазному комплексу присущ синергизм. Количественно синергизм оценивается коэффициентом синергизма ? Ксин. Коэффициен синергизма равен отношению скорости образования продуктов гидролиза при одновременном действии ферментов к сумме скоростей их индивидуального действия. Синергизм зависит от концентрации субстрата (с увеличением концентрации Ксин уменьшается и стремится к единице) и соотношения концентраций ферментов (с увеличением относительной концентрации целлобиогидролазы Ксин уменьшается и стремится к единице). Считается, что синергизм в действии целлюлазного комплекса на нерастворимую целлюлозу является проявлением кинетических особенностей последовательно и параллельно действующей полиферментной системы [22]. Целлюлолитическая активность ферментов связана с их адсорбционной способностью на целлюлозе: чем выше эта способность, тем выше эффективность процесса ферментативного гидролиза целлюлозы.

Содержание индивидуальных целлюлолитических ферментов в целлюлазных комплексах варьирует в зависимости от их происхождения. В итоге кинетика и выход глюкозы в ходе ферментативного гидролиза целлюлозы для различных препаратов различны. С целью повышения выхода глюкозы необходимо предупредить накопления целлобиозы, которая является ингибитором ферментативной реакции, путём корректировки состава целлюлолитического комплекса – дополнительного введения целлобиазы из другого источника.

В России широко используют ферментный препарат «Целловиридин», который получают высушиванием очищеного ультроконцентрата культуральной жидкости штаммов гриба Trichoderma viride (Tr. reesei 18б2/КК). Препарат содержит комплекс ферментов, гидролизующих некрахмалистые полисахариды растительного сырья. В промышленности производят два вида этого препарата «Целловиридин Г20х» (ТУ 9291-008-05800805-93) и «Целловиридин-5000» (ТУоп. 34588571-012-94).

Характеристики ферментных препаратов приводятся в таблице 2.1.

2.1. Характеристики ферментных препаратов «Целловиридин»

Оптимальное действие ферментного препарата «Целловиридин» проявляется при температуре 50±0,2оС и значениях рН 5,0±0,5. Срок хранения препарата 12 месяцев при температуре не более 25оС. Нормы внесения (ЦлА 2000 ед/г) 0,001-0,025% к массе зернопродукта.

Целлюлолитическими ферментами расщепляется также основная цепь гемицеллюлозы ? ?-D-ксило-?-D-глюкана, боковые цепи отщепляют глюкозидазы.

В России начали производить мультиэнзимные ферментные препараты МЭК-СХ-1 и 2, обладающие целлюлолитической активностью (185 ед.на г).